温度胁迫下棉花粉蚧热激蛋白基因的表达分析

【目的】为了研究热激蛋白 Hsp70, Hsp70-4和Hsp90在棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis抵抗逆温中的作用。【方法】在测序棉花粉蚧转录组的基础上,分析了该虫热激蛋白Hsp70基因家族的2个序列［Pshsp70（GenBank登录号为KJ909505）和Pshsp70-4（GenBank登录号为KJ909506）］和Hsp90基因家族的1个序列,［Pshsp90(GenBank登录号为KJ909507)］,采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测了在不同温度（18和32℃恒温, 37, 39, 41, 43和45℃热激1 h 后26℃恢复1 h)下棉花粉蚧不同发育阶段（2龄若虫、3龄若虫、雌成虫）3种热激蛋白基因的表达量。【结果】Pshsp70 cDNA序列包含1 923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,理论分子量和等电点分别为70.9 kDa和5.65; Pshsp70-4 cDNA序列包含1 962 bp的开放阅读框,编码654个氨基酸,理论分子量和等电点分别为71.8 kDa和5.38;Pshsp90 cDNA序列包含2 172 bp的开放阅读框,编码724个氨基酸,理论分子量和等电点分别为83.5 kDa和4.93。Pshsp70 和Pshsp70-4均含有Hsp70基因家族高度保守的基序,Pshsp70编码的氨基酸序列与烟粉虱Bemisia tabaci和家蚕Bombyx mori等昆虫的Hsp70 的氨基酸序列一致性为 85%;Pshsp70-4编码的氨基酸序列与白蜡蚧Ericerus pela和点蜂缘蝽Riptortus pedestris等昆虫的Hsp70的氨基酸序列一致性高达95%;Pshsp90也含有Hsp90基因家族高度保守的基序,Pshsp90编码的氨基酸序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum和东亚小花蝽Orius sauteri等昆虫的Hsp90 的氨基酸序列一致性为 87%。热激蛋白基因表达量分析结果表明,在18℃恒温条件下,粉蚧2龄若虫的3个PsHsps基因的mRNA相对表达量均比对照(26℃)低,在32℃恒温条件下,各龄期的Hsp70基因的相对表达量均显著高于对照。在37~45℃下热激1 h并在26℃下恢复1 h,棉花粉蚧3个龄期的3个热激蛋白PsHsps基因的相对表达量随温度的升高总体呈增加趋势,相关性分析表明,除Pshsp70-4在雌成虫中的表达量与热胁迫温度的相关系数为0.225外,各龄期中3个基因的表达量与温度的相关系数均大于0.6,显著相关;43℃和45℃胁迫下,各龄期的3个热激蛋白基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】棉花粉蚧热激蛋白基因的表达与温度呈正相关,在该虫应对高温中起着重要作用。     

中国甜菜夜蛾地理种群的遗传分化与基因流

【目的】为了明确我国甜菜夜蛾Spodoptera exigua地理种群间的遗传分化及基因流,阐明该种害虫在我国的种群历史动态。【方法】本研究对采自我国20个地理种群的529头甜菜夜蛾样品进行线粒体COI基因序列测定与分析,利用DnaSP 5.0和Arlequin 3.11软件分析种群间遗传多样性、遗传分化、基因流水平及分子变异,构建了单倍型系统发育树与单倍型网络图。【结果】在所分析的所有529个序列样本中,共检测出10个单倍型,其中Hap_1为所有种群所共享。总群体遗传多样性较低（Hd=0.257±0.025,Pi=0.0007±0.0001,Kxy=0.323）,群体间遗传分化较小（F_ST=0.211）,基因流水平较高（N_m=1.870）。AMOVA分析表明,甜菜夜蛾遗传变异主要来自种群内,种群间变异水平较低。各种群间遗传分化程度与地理距离无显著相关性（R²=0.005,P>0.05）。各单倍型相互散布在不同种群中,未形成明显系统地理结构。中性检验（Tajima’s D=-2.177, P<0.05; Fu’s F_S=-8.629, P<0.05)与错配分布分析表明,我国甜菜夜蛾种群曾经历种群近期扩张。【结论】研究结果揭示,甜菜夜蛾各种群间的基因交流并未受到地理距离的影响,验证了甜菜夜蛾具有高度的迁飞能力。     

白血病相关蛋白16与角蛋白18相互作用的鉴定

目的：验证白血病相关蛋白（LRP）16与角蛋白（KRT）家族成员KRT18之间的相互作用关系。方法：PCR扩增KRT18及其结构域缺失体基因片段,构建KRT18全长及其结构域真核表达载体,通过体外GST pull down实验和体内免疫共沉淀实验验证LRP16/KRT18的相互作用,并鉴定其作用的结构域。结果：构建了KRT18及其结构域重组子,GST pull down实验证明LRP16与KRT18在体外存在相互作用,它们的特异结合区域位于KRT18的C端,KRT18能够与LRP16的C端结构域相互作用;免疫共沉淀实验表明内源性LRP16与KRT18的C端在体内存在特异结合。结论：KRT18与LRP16存在相互作用,为进一步研究KRT18影响LRP16的亚细胞分布及调控LRP16核功能执行的作用机制奠定了基础。     

热激蛋白70研究进展

热激蛋白70（HSP70）是广泛存在且高度保守的蛋白,作为伴侣分子能够促进蛋白折叠;HSP70可以通过阻止细胞色素c从线粒体释放,与凋亡诱导因子结合使其不能入核,或者抑制JNK激酶活性调节细胞凋亡;HSP70可以调节细胞周期进程,促进细胞生长,阻止细胞衰老;免疫功能研究表明HSP70是有效的免疫佐剂,可激发抗原特异性的CTL反应,同时细胞外HSP70和膜结合HSP70可激发非特异性免疫反应。     

普通烟草K^＋通道基因NKT4的克隆、序列和表达分析

通过比对拟南芥、胡萝卜、番茄和马铃薯的K+通道氨基酸序列得到了保守序列,设计1对简并引物,利用RT-PCR获得3条490bp的普通烟草K+通道基因中间片段.以其中一条中间片段设计特异性引物,应用RACE方法得到5′末端和3′末端cDNA序列.通过拼接并结合全长克隆及测序验证,获得一个未报道的普通烟草K+通道基因,并将其命名为NKT4(GenBank登录号为FJ233071).NKT4的cDNA全长为2937bp,其中5′非编码区45bp、编码区2679bp、3′非编码区213bp;编码区编码892个AA.构建了一个烟草、拟南芥及相关植物K+通道蛋白的系统进化树.基因表达分析表明,NKT4主要在烟草主根和侧根中表达,在烟草叶中也有少量表达.     

香蕉凝集素基因的克隆及在成熟果实中的特异性表达

采用RT-PCR的方法克隆香蕉凝集素(Bankc)基因,对其全序列进行了测定并与已发表的BanLec基因序列进行了比较。采用定量PCR的方法对该基因在果实成熟过程中和香蕉不同组织中的表达进行了研究,结果表明：BanLec基因的表达同时具有发育特异性和组织特异性,即仅在果实中表达,而且其表达量随果实成熟度的变化而变化。     

药用野生稻转育后代一个抗白叶枯病新基因的定位

从药用野生稻渗入后代选育的水稻株系B5表现为高抗褐飞虱、白背飞虱和白叶枯病。对B5与籼稻品种明恢63杂交组合的187个重组自交系(RILs)进行了抗白叶枯病接种鉴定,采用分离集团分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA),在第1染色体上筛选到与水稻抗白叶枯病基因相连锁RFLP分子标记。利用RILs抗病性表现型鉴定资料和构建的分子标记连锁图谱,将抗白叶枯病基因定位在第1染色体短臂的C904和R596之间,这两个分子标记间遗传距离为1．3cM。该基因对RILs群体抗病性变异的贡献率为52．96％,是一效应值较大的主效基因。这一抗白叶枯病基因不同于已报道的抗白叶枯病基因的位点,因此将其命名为Xa29(t)。     

奶牛γ干扰素基因的高效表达及活性测定

经刀豆素(conA)刺激诱导奶牛外周血淋巴细胞,应用RT-PCR方法从其总RNA中对奶牛γ干扰素基因cDNA进行扩增,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,与已知序列同源性为100%.然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达,经SDS-PAGE分析,原核表达产物为16kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的42%,表达产物以包涵体形式存在.经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及0.5mol/L盐酸胍复性液处理,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化,细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-γ具有较高的干扰素活性,约为6.0×105U/mg.     

高等植物叶绿体基因组的转化

介绍了高等植物叶绿体基因组转化技术的原理和优点,外源基因导入叶绿体基因组的方法,外源基因与叶绿体基因组的整合及其表达,常用的叶绿体基因组转化的筛选标记基因及其去除的研究进展.     

黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)GICC2773基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1．4kb和下游约1．3kb两段DNA序列,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5′和3′端,构建成重组质粒pMW1-pepB,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体-PEG方法,将酶切pMW1-pepB得到的线性片段转化A．niger GICC2773菌株,通过潮霉素选择平板得到62个Hgy抗性转化子,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB29。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降,外源蛋白漆酶的分泌表达有所提高。