日本血吸虫三价DNA疫苗pVIVO2 SjFABP/Sj26.SjGAPDH的构建及其免疫保护作用评价

目的:构建含有日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABP),3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjGAPDH),26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26)的三价DNA疫苗,并通过药理实验评价其抗血吸虫感染的免疫保护作用。 方法:  以血吸虫成虫RNA为模板制备cDNA第一链,RT-PCR扩增得到抗原基因片段,再通过重组PCR技术,将Sj26和SjGAPDH融合为Sj26.SjGAPDH基因。将SjFABP和Sj26.SjGAPDH分别克隆入pVIVO2的mcs1和mcs2,获得重组质粒pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH。瞬时转染MCF-7细胞,通过逆转录PCR（RT-PCR）检测抗原基因在mRNA水平的表达,通过间接荧光免疫（IIF）检测抗原基因在小鼠体内抗原水平表达,验证了DNA疫苗的有效性;并免疫小鼠后进行免疫保护性初步试验。结果:  经过酶切、测序及体内外表达验证,该三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH构建成功;该三价DNA疫苗在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率达到58.6%和59.8%。结论:  该三价DNA疫苗组具有比单价和双价DNA疫苗组更加良好的免疫保护作用,为日本血吸虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因UGT1A7基因多态性与肝硬化易感性关系的研究

目的:探讨UGT1A7基因多态性与肝硬化易感性之间的关系.方法:设置150例肝硬化汉族住院患者组与100例性别/年龄相匹配的志愿者对照组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测肝硬化组与正常组中UGT1A7的基因多态性,并进行统计学分析.结果:肝硬化组中C2等位基因型与对照组相比明显升高,P＜0.001,差异有显著性意义.结论:肝硬化与UGT1A7基因相关,UGT1A7等位基因C2可能是肝硬化发生的危险因素.     

放线菌模块型聚酮合酶的系统发育组学分析及其在聚酮类化合物筛选中的应用

【目的】通过分析模块型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)的系统进化关系,阐明酮基合成酶(ketosynthase,KS)和酰基转移酶(acyltransferase,AT)序列与聚酮产物之间的关系,为放线菌天然产物的筛选提供指导。【方法】从PKSDB数据库的20个模块型PKS基因簇中调取所有KS(190个)和AT(195个)氨基酸序列,利用MEGA 4.0软件分别构建KS、AT、KS+AT 3种序列模式的系统发育树,并计算KS序列的簇内和簇间平均进化距离。设计了一对KS结构域的引物,通过PCR方法对20株活性放线菌分离菌株进行了筛选,测定了阳性菌株的KS序列,和已知的相关KS序列构建系统发育树,并对阳性菌株进行了发酵培养和代谢产物分析。【结果】放线菌来源的同一PKS的KS序列倾向于聚成一个进化枝,且按照其产物结构聚类;同一PKS的KS簇内平均进化距离小于0.300,不同PKS的KS簇间平均进化距离一般大于0.300。AT系统发育树按照其底物特异性聚成两个大的分枝;同一PKS的部分AT分别处于两个分枝,其余AT散在分布。KS+AT系统发育树则综合了KS树和AT树的拓扑结构特点。获得13株KS阳性分离菌株,它们的多数KS序列按照菌株分别聚类,其中4株菌的大部分KS各自聚成独特的簇,5株菌的大部分KS分别处在已知PKS进化枝内。从3株阳性菌中分离到预期的聚酮类产物。【结论】放线菌中KS的进化方式以垂直进化为主,而AT则以水平进化为主;KS序列与产物结构相关,且KS簇间平均进化距离可作为不同PKS的判定标准;相对于AT和KS+AT,KS系统发育组学分析更适用于指导放线菌聚酮类产物的筛选。     

光呼吸途径中两种转氨酶的研究进展

植物丝氨酸：乙醛酸氨基转移酶（SGAT）与谷氨酸：乙醛酸氨基转移酶（GGAT）主要催乙醛酸的转氨反应,是光呼吸途径中的两种关键酶。此两种酶大都为二聚体,在高等植物体内主要位于过氧化物酶体内,而在真核藻类植物体内则位于线粒体内,对植物的生长发育与抗逆性具有重要影响。本文对SGAT与GGAT在植物光合作用、氨基酸代谢和抗逆性等方面的研究进展进行了综述,以期对SGAT与GGAT的研究有所帮助。     

野桑蚕谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）基因的诱导表达定量分析

谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）在机体的解毒代谢和抗氧化中起重要作用。为了从分子水平上探究野桑蚕Bombyx mandarina对杀虫剂抗性的产生机理,本研究采用实时荧光定量RT-PCR方法,对GSTs基因在正常饲养野桑蚕5龄幼虫及用敌敌畏和溴氰菊酯处理5龄幼虫不同组织中的转录水平进行检测,并采用Actin3内源参照基因对检测结果进行归一化处理。结果表明：用敌敌畏和溴氰菊酯处理5龄幼虫24 h后,GSTs基因在各组织中的诱导转录水平存在差异,但GSTs基因在脂肪体中的诱导转录水平最高,其次为中肠,可能与这2种组织是野桑蚕主要的解毒器官有关。其中,GSTe2和GSTe5基因诱导转录水平相对较高,推测这2个基因可能主要参与野桑蚕对外源物质的解毒代谢。     

PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节

蛋白激酶C相互作用蛋白1(protein interacting with Ckinase1,PICK1)是调节AMPA(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体在细胞膜上的数量与分布,引起LTP与LTD现象的重要蛋白.本文利用基因克隆、荧光光谱以及免疫分析等方法,分析了PICK1蛋白C末端酸性区对BAR结构域与膜脂结合能力以及PICK1分子内BAR(Bin/amphiphysin/RVS)结构域与PDZ结构域相互作用的影响,研究了钙离子结合C末端酸性区后对上述相互作用的调节.结果显示,C末端酸性区的存在使BAR结构域与膜脂的结合能力减弱大约10倍,但PICK1分子内的BAR与PDZ结构域的相互作用与不含C末端的酸性区相比增强了大约4倍.另一方面,C末端酸性区的存在,伴随钙离子浓度的提高,有助于增强BAR与膜脂的结合,却削弱了PDZ和BAR结构域的作用.当钙离子浓度增加到500μmol/L时,BARC的脂质结合能力以及和PDZ的亲和力与不含酸性区相当.     

一种鉴定过氧化氢酶活性的铁染色法

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,建立了一种新的鉴定过氧化氢酶活性的方法──铁染色法．结果表明,细菌过氧化氢酶及牛肝过氧化氢酶显示单一的酶活性带．该方法操作简单、快速、灵敏度高、专一性强.是一种切实可行的鉴定过氧化氢酶活性染色法.     

甲硫氨酸腺苷转移酶1A/2A平衡与肝细胞癌

肝细胞癌是一种死亡率极高的癌症,大多数病人发现时已属晚期.甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)是细胞生命活动的关键酶,可以通过催化甲酼氨酸和三磷酸腺苷(ATP)结合,促进生物甲基供体S-腺苷甲酼氨酸(SAMe)的生物合成.正常肝细胞中MAT1A与MAT2A存在动态平衡,共同维持细胞内SAMe稳态;肝细胞癌中MAT1A转变成MAT2A,会使SAMe生物合成减少,为癌细胞生长提供有利条件,故MAT1A表达降低而MAT2A增高.因此,促进MAT2A向MAT1A转化,进而提高MAT1A/MAT2A的比值可能成为治疗肝细胞癌的关键靶点之一.本文就MAT1A/MAT2A平衡在肝细胞癌中的重要作用作一综述,旨在为寻找肝细胞癌防治靶点提供新的思路.     

NAMPT 真核表达载体构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的:为探索烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)对肝癌细胞增殖的影响,构建pc DNA3.1(+)-NAMPT真核表达载体。方法:以正常肝细胞的c DNA为模板,通过PCR扩增得到NAMPT全长序列,经酶切、连接、转化等步骤构建真核表达载体。重组质粒经酶切鉴定及测序验证后,用脂质体转染法转染肝癌细胞MHCC-97H和正常肝细胞HL-7702,免疫印迹检测NAMPT蛋白表达情况;WST实验检测过表达NAMPT后对MHCC-97H和HL-7702增殖的影响。结果:真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT构建成功,转染HL-7702和MHCC-97H细胞后,NAMPT蛋白表达水平较空白组分别升高了83%和180%;过表达NAMPT可促进细胞增殖,而抑制NAMPT活性后,细胞增殖被抑制(P0.001)。结论:成功构建了真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT,并发现NAMPT表达水平与细胞增殖密切相关,为进一步探索NAMPT表达在肝癌细胞增殖的分子作用机制和筛选新的肿瘤药物靶点奠定了基础。     

胰岛素受体信号传递

胰岛素受体是具有酪氨酸蛋白激酶活性的膜受体。胰岛素与靶细胞相应受体结合后,引起受体酪氨酸残基自身磷酸化及β亚基酪氨酸蛋白激酶活化,后者使靶细胞内底物如IRS1或Hhc的酪氨酸残基磷酸化,酪氨酸蛋白激酶在胰岛素受体信号传递中发挥重要作用。胰岛素信号所激发的信号传递途径主要有二：一为Ras-MAP激酶途径,一为PI3－激酶途径,胰岛素的作用与此有关。