GST-pulldown体外研究LRP16与NF-κB/p65相互作用的功能表位

目的:构建核转录因子NF-κB/p65亚基的功能表位载体,采用GST-pulldown探究p65与LRP16体外相互作用的功能表位。方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-p65为模板,PCR扩增一组p65功能表位的基因片段,经测序后,克隆至pcDNA3-flag载体上,用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切重组质粒鉴定目的片段大小,然后采用GST-pulldown实验验证LRP16与p65之间的相互作用。结果:构建了p65的5个功能表位的表达载体且可用于体外转录翻译,GST-pulldown体外研究表明,p65蛋白N端RHD结构域是与LRP16相互作用所必需的,p65的RHD结构域的缺失完全消除了p65与LRP16的体外相互作用。结论:GST-pulldown实验验证了LRP16与p65存在体外直接相互作用,并具体分析了LRP16与p65相互作用的表位。     

Cas9/sgRNA递送技术及其研究进展

在与CRISPR/Cas9基因编辑技术相关的临床应用中,Cas9/sgRNA的递送是决定基因编辑治疗效果的关键技术之一。无需转录和翻译过程的Cas9蛋白/sgRNA复合物直接递送形式可能能够提供更高的特异性和安全性。文中通过对Cas9/sgRNA递送技术的研究现状及其在基因相关疾病治疗中的进展进行简要综述,为新型药物载体的设计和基因治疗的临床应用提供新思路。     

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的裸花紫珠水提物化学成分分析

为了对裸花紫珠水提物的化学成分进行分析鉴定,本研究以加热回流提取法制备裸花紫珠水提物,并采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS/MS)通过高分辨质谱数据并结合相关文献,分析鉴定水提物的化学成分。最终从裸花紫珠药材水提物中共鉴定出37个化学成分,包括5个黄酮类化合物,16个苯乙醇苷类化合物及16个环烯醚萜类化合物。其中,京尼平苷酸、连翘脂苷E、肉苁蓉苷F为首次从裸花紫珠中报道。并推测木犀草苷、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为裸花紫珠的标志性成分,可为裸花紫珠后续药效物质基础研究及中成药二次开发和质量控制提供参考。     

红系细胞中Cre重组酶介导的位点特异性片段交换

Cre介导的片段交换技术利用重组酶Cre的位点特异性重组特性 ,在基因组的特定位点进行靶片段与目的片段的交换。运用互为反向的Lox位点 ,在鼠红白血病MEL细胞中进行靶载体的整合和交换载体的交换 ,探讨在特定的染色质环境下红系特异性顺式作用元件的功能。电穿孔转染MEL细胞后从含有潮霉素 (hygromycin)的选择性半固体培养基中挑取MEL细胞单克隆 ,通过PCR和Southern杂交鉴定整合完整性和拷贝数 ,获得三种整合有靶载体p1L HyTk L1 β EGFP neo的细胞株A ,B和D。交换载体pL1 HS2 1L(含有 732 bp的人β 珠蛋白基因簇 5′DNaseI高敏位点 2核心片段 )和Cre表达载体pBS185共转染细胞株A ,9 (1,3 二羟 2丙氧甲基 )鸟嘌呤 (gancyclovir)负筛选后挑取单细胞克隆A HS。PCR检测显示HS2片段以反方向进行了交换。流式细胞仪分析显示平均的荧光细胞百分比 (2 .4 2 % )低于未交换的细胞株A (35 .94 % )。A HS中EGFP的低表达可能是处于非容许方向的HS2片段出现方向依赖性基因沉默所致。     

益生菌Lactobacillus amylovorus S1对仔猪后肠菌群的影响

结合PCR/DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis,变性梯度凝胶电泳)和16S rDNA序列分析技术,研究添加益生菌Lactobacillus amylovorus S1后仔猪从7至35日龄（断奶后两周）后肠菌群的变化。6窝新生仔猪被随机分成两组：对照组和处理组,处理组仔猪于7、9和11日龄口服L. amylovorus S1菌液（活菌数5×10.9 CFU/mL）。分别于7、14、21、24和35日龄,每窝随机屠宰一头仔猪,收集肠道样品。比较不同日龄仔猪后肠菌群DGGE图谱表明,断奶后图谱中多数高GC含量细菌条带消失,至断奶后两周又逐渐出现。序列分析显示,这些高GC含量细菌主要为乳酸杆菌。统计分析表明,仔猪口服益生菌S1对其盲肠和结肠菌群的多样性指数无显著影响。通过比较处理组和对照组图谱发现,处理组14日龄出现一特异条带,与其匹配的序列的最相似已知菌为Clostridium disporicum,相似性为95％;而35日龄对照组有一特异优势条带,该条带被鉴定为猪链球菌（Streptococcus suis）,相似性为99％。     

Cre/Loxp和四环素系统在基因可控表达中的应用

本文介绍了目前最常见的四环素调控系统和Cre/LoxP系统的基本原理、应用情况、近年来的研究进展总结,比较了两种系统的优缺点,介绍了两种系统联合应用的成果,并且提出了Cre/Loxp系统在HPV11全基因组定向表达中的应用,并由此提出利用Cre/Loxp系统解决多个基因定向表达问题的设想。     

东北地区非鹅膏属真菌中鹅膏肽类毒素的分布

本文采用高效液相色谱（HPLC）法对采自中国东北地区的95份非鹅膏属真菌样本进行鹅膏肽类毒素（α-amanitin、β-amanitin、phalloidin）检测。为获得更准确的实验结果,对57份阳性反应样品利用UPLC-MS/MS进一步测定,值得注意的是,测定结果中褶纹丝盖伞Inocybe leiocephala确认同时含有以上3种毒素。本研究通过检测鹅膏肽类毒素在非鹅膏属真菌中的分布,对误食中毒事件的发生起到一定程度的预防和警示作用,另一方面筛选出含有鹅膏肽类毒素的新型毒菌资源,为毒菌资源的开发利用提供基础资料。     

污染足迹及其在区域水污染压力评估中的应用——以太湖流域上游湖州市为例

传统生态足迹理论虽然在可持续发展评价等方面得到了广泛的应用,但却仍然无法全面衡量人类活动对生态系统造成的各种影响。其无法全面评估人类活动的根源在于,土地功能排他性假设限制了其对利用生态系统非生物生产性产品和服务的人类活动的衡量。为了摆脱传统生态足迹理论的局限性,建议承认土地功能多样性的客观事实,将生态足迹构建于多种生态系统服务功能之上。针对传统生态足迹对定义中废弃物吸纳的考虑不足,提出了基于污染物吸纳功能的生态足迹,即污染足迹。污染足迹不是对传统生态足迹中能源足迹的简单置换,而是能够囊括人类活动产生的大部分污染物,并可以根据不同的污染物类别或类型进一步细化的足迹类型。构建了太湖流域有机物、氮和磷污染足迹模型,并利用该模型对流域上游湖州市的水污染压力进行了综合评估。结果表明:(1)2007年湖州市污染足迹为39948.73 hm²,东部平原地区污染足迹较大,西部丘陵地区污染足迹相对较小;(2)湖州市人类活动排放的氮磷污染物对水域空间的生态占用已经远远超过了有机污染物;(3)2007年湖州市污染承载力为20896.00 hm²,污染赤字为19052.73 hm²,人类排污活动俨然超出了当地水域的承载能力;(4)2007年湖州市污染压力指数为1.91,当地水环境总体上处于轻度接近中度污染压力;(5)湖州市水污染压力较大的地区,区域内人类活动的维持建立在区域水环境质量恶化或污染物向下游输移的基础之上。     

黄瓜叶片蛋白质双向电泳样品分级优化

以‘津研4号’苗期叶片为材料,采用聚乙二醇(PEG)分级沉淀法对黄瓜叶片蛋白质样品进行分级分离,将黄瓜叶片中存在的高丰度蛋白1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶特异性地集中于一个组分之中,以提高对黄瓜叶片蛋白质双向电泳中低丰度蛋白质的检测率.结果表明:(1)分级后各组分和全蛋白在SDS-PAGE谱带中差异显著,全蛋白得到了有效的分离.(2)二维电泳图谱上点的分辨率有很大的提高,所有组分的点数是未分级前的3倍之多.(3)浓度为24％的PEG-4000富集高丰度蛋白Rubisco的效果最好.该方法可推广应用于黄瓜叶片蛋白质组分析的样品制备.     

锁阳原花青素对葡萄糖/甘氨酸模拟体系糖基化终产物的抑制效果

为探究锁阳原花青素对葡萄糖/甘氨酸模拟体系中形成的晚期糖基化终产物(advanced glycation end-product,AGEs)的抑制效果。本实验考察了不同温度,不同反应时间下锁阳原花青素对体系中AGEs抑制的影响,同时探讨了多种金属离子对抑制效果的作用。结果表明:在80℃下加热75 min,锁阳原花青素的质量浓度为1 mg/mL时,对AGEs的抑制效果可达85.73%±1.57%,而100℃下加热30 min时抑制率达到74.01%±1.45%。当加入金属离子(Al³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺)时,对AGEs的形成既有抑制作用也有促进作用;与仅有锁阳原花青素存在时相比,金属离子在低浓度时减弱了锁阳原花青素对AGEs的抑制作用,高浓度差异显著。此结果可为天然AGEs抑制剂的开发和在食品中应用提供参考价值。