α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶(CGT酶)活性区域-3亚位点(47位赖氨酸残基),-7亚位点(146~152位氨基酸残基)以及环化中心位点(195位酪氨酸残基)对其催化底物形成γ-环糊精(CD)能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变:K47T,Y195I,以及146~152位氨基酸残基替换为异亮氨酸(命名为△6),并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化,利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明,和野生酶相比,所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面,突变酶Y195I的催化产物中,α-CD的含量由68%降为30%,β-CD由22.2%提高为33.3%;而γ-CD由8.9%提高为36.7%,含量提高了4倍,取代α-CD成为产物中的主要成分;γ-CD的实际产量为1.1 g/L,是野生酶(0.4 g/L)的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降,但仍然是产物中的主要组分,β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见,活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响,Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ-CD。纯化后突变酶Y195I的酶学性质试验表明,其最适反应温度和野生酶相同,但最适反应pH有所提高,且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此,突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。     

Dectin-1及相关细胞因子在足菌肿皮损中的表达

目的观察Dectin-1在真菌性足菌肿皮损中的表达,初步分析其在足菌肿发病中的作用。方法实验分为3组,A组8例足菌肿病例,B组为10例着色芽生菌病病例,A组和B组统称为感染组,C组为18例正常皮肤组织。应用免疫组化法检测3组病例的组织蜡块中Dectin-1、IL-4,IL-10,IFN-γ,TNF-α的表达。结果与正常组相比,感染组皮肤的Dectin-1、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10的积分光密度增高(P0.05)。A组与B组相比,两组间Dectin-1、IL-4、IFN-γ,TNF-α的积分光密度值比较无差异(P0.05)。结论真菌感染皮损中Dectin-1的表达上调,可能说明Dectin-1在足菌肿发病中具有一定作用。     

小麦辐射二代性状的数量遗传分析

本文采用生物统计和数量遗传学方法、分析了辐照剂量为0（对照）、15、25、35KR的铯─137γ射线对二个小麦品种的诱变效应及其选择效果;估算了七个数量性状的分布特征数和遗传方差、遗传变异系数、遗传力、遗传进度、相对遗传进度等遗传参数。辐射二代的变异较大,有大粒、大穗、早熟突变体出现;株粒重、穗粒重、穗长、穗粒数、抽穗期的遗传变异系数和相对遗传进度都较大,选择效果较好;铯-137γ射线能有效地应用于小麦辐射育种,且适宜辐照剂量为35KR。     

植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化pH范围的理性改造及高效转化生产g-氨基丁酸

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好。然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分。此外,随着产物γ-氨基丁酸的生成,溶液pH会逐渐上升,不利于GAD酶的持续转化。本研究首先从实验室保藏的一株高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择9个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体LpGAD^{S24R/D88R/Y309K}在催化pH区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍。接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理。此外,将Lpgad与Lpgad^{S24R/D88R/Y309K}突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) E01中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40 ℃,菌体量OD₆₀₀=20,底物L-谷氨酸100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为100 μmol/L。5 L发酵罐中,不调节pH,通过分批投料底物L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍。本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础。     

微生物法生产γ-癸内酯的初步研究

研究了耶罗威亚酵母(Yarrowia sp.)转化蓖麻油生成γ-癸内酯的过程.根据菌株的生长特性,确定底物蓖麻油的最适加入时间;分批培养菌体转化,γ-癸内酯产量为2.4 g/L;采用转化液接种进行二次转化,γ-癸内酯产量可提高到4.0 g/L;考察了溶氧条件变化对γ-癸内酯积累的影响.     

骨髓基质干细胞的诱导分化及其治疗癫痫的实验研究

目的探讨骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞的方法及脑内移植治疗大鼠癫痫模型的作用。方法无菌条件下分离纯化BMSCs,用bFGF 10ng/ml、RA0.5μmol/L的DMEM/F12诱导72h后,部分用于免疫荧光检测nestin,其余的继续用bFGF 10ng/ml、RA 0.5μmol/L及神经营养因子NT-3 20ng/ml、BDNF 20ng/ml的DMEM/F12诱导4d,检测GAD67。皮下注射匹罗卡品建立癫痫大鼠模型,采用行为学分析筛选模型。通过立体定位仪,用微量注射器将BMSCs来源的神经干细胞和神经营养因子移植入癫痫鼠海马内,观察大鼠行为变化,存活2、4周后,心脏灌注取脑,冰冻切片免疫组化双标检测移植细胞的存活、迁移、分化情况。结果BMSCs诱导72h后,nestin表达阳性,4d后GAD67检测60%阳性。采用匹罗卡品造模,方法简便,但死亡率较高,仅15%-20%的动物造模成功。BMSCs源神经干细胞移植后可在海马内存活,向周围的脑区内迁移和整合。结论BMSCs源的神经干细胞在体外可诱导为γ-氨基丁酸能神经元并且对慢性癫痫有一定的治疗作用。     

60Coγ射线对高免卵黄液中EDS-76病毒灭活的研究

用不同剂量、剂量率的^60Coγ射线对卵黄液中的EDS-76病毒进行辐照,研究了其对病毒的灭活效果和对卵黄抗体(IgY)的影响。结果表明,^60Coγ射线辐照,可以灭活高免卵黄液中的EDS-76病毒,且随辐照剂量、剂量率的增大,灭活率也增高;EDS-76病毒在卵黄液中的D10值为0．57kGy～0．60kGy;6．0kGy的辐照剂量,可以将高免卵黄液中的EDS-76病毒完全灭活,且不影响卵黄抗体效价,该卵黄抗体稳定性好、耐酸、耐热、耐蛋白酶消化。     

genistein对沙眼衣原体感染细胞信号转导的影响

研究酪氨酸激酶抑制剂 genistein对IFN γ诱导沙眼衣原体感染细胞内信号转导的影响。以IFN γ作用于沙眼衣原体 (K血清型 )感染的McCoy细胞 ,用 genistein阻断IFN γ对沙眼衣原体感染细胞的作用。用台盼蓝染色法检测沙眼衣原体感染细胞存活率。用免疫印迹法检测蛋白酪氨酸激酶磷酸化及JAK1/STAT1活化的改变。结果显示 :genistein可拮抗IFN γ降低沙眼衣原体感染细胞存活率的作用 ,且具有剂量依赖效应。genistein可抑制IFN γ诱导的沙眼衣原体感染细胞蛋白酪氨酸激酶磷酸化及JAK1/STAT1活化 ,此作用且与genistein作用的剂量有关。     

高产γ-PGA菌株的分离筛选与菌种初步鉴定

从高温处理过的腐乳和豆豉中分离到一系列单菌落,通过不同的培养基初筛、复筛,得到一株高产-γPGA的菌株N6,根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版,对N6进行了形态和生理生化特征的分析,以及对产物进行了红外光谱法测定,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。     

猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有猪γ-干扰素(porcine interferon-γ,PoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-PoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达PoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗进行Western blot、间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,结果表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得正确表达。抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达rPoIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在猪肾细胞系(PK-15)的复制,rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清抗病毒活性为2×104抑制单位(IU)/mL,其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清有效阻断。结果表明rPoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ在感染昆虫细胞获得有效表达,并具有高效抗病毒活性。