金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

综合运用cDNA末端快速扩增 (RapidAmplificationofcDNAEnds ,RACE )和基因组步行等技术克隆到一个金针菇 (Flammulinavelutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA ,经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族 ,与已发表的漆酶基因 (AF176 2 30 )的同源性最高 ,在氨基酸水平为 72 %。该结构基因命名为gl ccFv,cDNA命名为lccFv ,其序列提交GenBank ,登录号分别为AY4 85 82 6和AY4 5 0 4 0 6。将lccFv的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体pHBM90 6 ,转化毕赤酵母GS115且实现了分泌表达。将重组毕赤酵母GS115 (pHBM5 6 5 )诱导产酶 ,在培养温度 2 0℃、甲醇流加量为 1 0 % (V V)的情况下 ,其分泌表达的LCCFv的最高酶活为 0 10 70U mL ,最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH值为 3 9,在最适反应条件下其热稳定性和pH值稳定性均较好     

家蚕抗菌肽在毕赤酵母中的表达

目的：用毕赤酵母真核系统表达有抑菌活性的家蚕抗菌肽(cecropin-XJ)。将pGEX-4T-1-cecropin-XJ上的抗菌肽基因cecropin—XJ克隆至穿梭质粒pSuperY上,用Bln Ⅰ酶切使之线性化后,采用电击法转化酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵,经SDS—PAGE检测,表达产物可以在α信号因子的引导下,分泌到培养基中,且表达产物具有明显抑菌活性。     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。     

家兔脑内微量注射或脊髓珠网膜下腔注射氟安定的呼吸抑制作用

实验在49只局部麻醉、肌肉麻痹、切断双侧颈迷走神经的家兔上进行。观察到一侧孤束核(NTS)区微量注射氟安定,使对侧膈神经放电平均幅度减低,呼吸频率加快。事先在NTS区微量注射GABA 受体拮抗剂印防己毒素,可阻断氟安定的减低膈神经放电平均幅度的作用。在脑桥头端横断脑干出现长吸式呼吸的免上,一侧NTS区微量注射氟安定,也使对侧膈神经放电平均幅度减低,但呼吸频率减慢。在脑桥结合臂旁内侧核(NPBM)区微量注射氟安定,使呼吸频率明显减慢,吸气和呼气时程延长,这效应可被毒扁豆碱阻断。脊髓蛛网膜下腔注射氟安定,使膈神经放电平均幅度减低,血压下降,这效应可被印防己毒素阻断。结果提示,NPBM 的存在与呼吸频率加快有关;而氟安定作用于NPBM区,却减慢呼吸频率,其机制可能是抗胆碱能作用。氟安定直接作用于NTS 区或脊髓使膈神经放电平均幅度减低、血压下降,其机制可能与激活GABA 受体有关。     

利用枯草杆菌α-淀粉酶分泌载体合成和分泌具有生物活性的鼠β干扰素

经BAL31酶消化除去信号序列的鼠β-干扰素(IFN-β)cDNA,引入到用枯草杆菌α-淀粉酶基因的启动子和信号序列所构造的一个枯草杆菌分泌载体中。把得到的嵌合质粒转移进枯草杆菌207-25中。采用菌落杂交和一种新的、用于分泌蛋白质的免疫印迹方法选出四株卡那霉素抗性转化株。这些转化株把与羊抗-IFN-β血清起交叉 反应的蛋白分泌到培养基中去。用L细胞和水泡性口膜炎病毒系统检测,其中一株表达一种高IFN-β活性,而其它三株表现弱的或没有IFN-β活性。基于我们先前的研究[Ohmura等人,Nucl.Acids Res.12(1984)5307-5319],认为这种分泌的IFN分子是杂种蛋白,在这分子中,NH_2-末端区域由一部分α-淀粉酶信号肽组成。核苷酸序列分析指出:表达高IFN活性的pTUB502质粒是与来自鼠的成熟蛋白质的密码子位置6的IFN-β基因连接。其它三个质粒,pTUB506、pTUB509和pTUB519分别含有来自密码子位置3,1和5的鼠IFN-β基因。鼠IFN-β的NH_2-未端区域似乎与它的生物活性紧密相关。     

海洋滑翔者

人类的侏儒症是指身高低于同龄小儿标准身高30％以上,或成年人身高在120厘米以下。侏儒症患者幼年时生长激素分泌不足,导致生长迟缓,短小的身材和骨骼不成比例地生长。     

细菌毒力因子的分泌机制

不同种类细菌的毒素、酶、菌毛、外膜蛋白等毒力因子的分泌（包括装配）机制往往有相似之处,可将革兰阴性菌毒力因子的分泌机制分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ４种类型,而革兰阳性菌则单独有一套较为简单的分泌系统。     

圈养马麝的胆量个性及与麝香分泌和繁殖成效的关系

采用新异物刺激的方式,建立马麝惊扰反应强度指数,通过马麝惊扰后的状态量化其胆量水平,对甘肃兴隆山麝场圈养马麝交配季节和非交配季节胆量(Boldness)进行行为学研究。结合泌香量和产仔量数据,分析胆量对麝香分泌、繁殖成效的效应;同时分析了圈区环境、性别、年龄与马麝胆量之间的关系,以及交配季节与非交配季节间胆量的相关性。结果表明:圈区环境对个体胆量无显著影响(交配季节P = 0.799;非交配季节P =0.152),性别对个体胆量也无显著影响(交配季节P = 0.144;非交配季节P = 0.733),而年龄对个体胆量存在显著影响(交配季节P = 0.012;非交配季节P =0.009),个体年龄越大,胆量越大;交配季节与非交配季节之间胆量呈显著正相关(r =0.592,P < 0.001),但并无明显差异(P =0.095);雄麝泌香量与非交配季节胆量之间存在显著负相关(r = - 0.607,P = 0.016),雌麝繁殖成效与交配季节胆量之间存在显著正相关(r =0.362,P = 0.045)。圈养马麝胆量个性受年龄因素的影响,并在交配季节与非交配季节之间存在一致性,非交配季节胆量更高的雄麝泌香量趋于更少,交配季节胆量更高的雌麝产仔数趋于更多。     

兔下丘脑室旁核刺激引起的肾交感神经传出活动的抑制

本实验用家兔,氯醛糖及尿酯混合静脉麻醉,制动,人工呼吸,颈部分离出三对神经——迷走、窦及主动脉神经,以备实验中切断。记录股动脉压、肾交感神经传出性放电活动(RSED)及其频率幅度直方图。借助脑立体定向仪刺激下丘脑室旁核,当刺激较强时,在交感神经放电短暂增加之后,可引起血压升高及RSED抑制。这一抑制过程可分为两个时相:血压不变期间的初期抑制时相及与血压升高同时并存的后期抑制时相。实验发现RSED总抑制时程及后期抑制时程均与血压变动具有正相关关系,而初期抑制时程与血压变动无相关关系。切断压力感受性神经前后,虽初期抑制时程的均值无显著差异,但在切断压力感受性神经后,总抑制时程及后期抑制时程的均值大大缩短。当用较弱刺激施于室旁核时,可不引起血压变化,但仍能引起RSED抑制。这个抑制亦可因切断压力感受神经而显著缩短。上述实验结果表明:(1) 在中枢内存在着一个室旁核-肾交感传出系统的抑制机制;(2) 初期抑制来源于中枢性抑制机制,而后期抑制时相主要来源于压力感受性反射,但亦有中枢抑制机制的参与;(3) RSED的中枢抑制可能并不是兴奋后压抑,而是自室旁核至脊髓交感节前神经元的主动性抑制。     

海伦脑炎微孢子虫分泌蛋白EhPTP4对宿主内质网蛋白降解通路的调控作用

【目的】微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核病原微生物,能够感染人类和几乎所有的动物。本课题以海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoon hellem）为研究对象,探讨其极管蛋白4（EhPTP4）作为一个潜在的分泌性毒力因子在宿主细胞内的定位和功能。【方法】制备EhPTP4的鼠源多克隆抗体,利用间接免疫荧光分析和Western blotting确定EhPTP4在感染细胞中的亚细胞定位;基于序列特征,在HEK293细胞中转染野生型和突变体EhPTP4,分析该蛋白的定位及其对病原增殖的作用;利用RNA-seq对转染EhPTP4的HEK293细胞进行转录组测序,分析EhPTP4引起的宿主基因表达和通路的变化;进一步通过RNAi和细胞转染分析差异表达基因的调控作用,利用RT-qPCR和Western blotting验证调控效果。【结果】EhPTP4的N端具有信号肽,C端具有富含组氨酸的结构域（HRD）和核定位信号序列（NLS）。蛋白定位分析显示,在感染和转染细胞中,EhPTP4均被分泌至宿主细胞核内。在HEK293细胞中过表达EhPTP4显著促进了病原的增殖。RNA-seq和蛋白泛素化分...