基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征北大核心CSCD

融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞,保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性,其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞,降低放疗的效果。为此,根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2或MMP-9的特点,在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)之间融合MMP-2/9的底物肽X,设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽,从而无法进入肿瘤细胞,进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中,得到表达质粒,并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化,分子量约为47 kDa,与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中,HepG2的MMP-2活力极低,但在3D培养模型中,随着培养时间的增加,HepG2肿瘤球的体积变大,其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率,但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。     

大孔树脂吸附与反相色谱纯化恩拉霉素

恩拉霉素作为多肽类抗生素,是一种新型、安全的饲料添加剂。本文建立了一条基于大孔树脂初纯和反相色谱精制的分离纯化工艺。该工艺路线首先使用AB-8大孔树脂在0.012 mol/L盐酸溶液-甲醇(50:50,V/V)缓冲液条件下洗脱实现恩拉霉素初步纯化,再使用制备型C18反相色谱柱在0.05 mol/L磷酸二氢钠-乙腈(70:30,V/V)(p H 4.5)缓冲液洗脱下实现恩拉霉素a和b的有效分离,a、b两个组分纯度分别达到98.5%和98.0%,a和b两种有效成分的总收率为29.2%。本研究为恩拉霉素a和b两种纯品的制备以及高纯度恩拉霉素产品的生产提供了参考。     

黑芝麻多酚氧化酶的重组表达及其酶学特性

为明确黑芝麻多酚氧化酶的酶学性质,利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达了黑芝麻多酚氧化酶 (Black sesame polyphenol oxidase,BsPPO)。将合成的基因构建至pMAL-c5x载体,并在大肠杆菌中进行表达,对重组蛋白进行分离纯化及融合标签切除,获得的BsPPO蛋白用于酶学性质探究。结果表明,合成的Bsppo基因1 752 bp,编码585个氨基酸,理论蛋白分子量为65.3 kDa;构建的pMAL-c5x-Bsppo重组质粒在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中可溶表达了MBP-BsPPO蛋白;酶切去除MBP融合标签后对BsPPO进行了酶学性质研究,结果表明BsPPO的最适温度和pH分别为25 ℃和4.0,在低温和弱酸性环境中有较好的稳定性。短时间低强度的光照和Cu2+可激活BsPPO的活性,Zn2+和Ca2+能抑制其活性。BsPPO可催化单酚、二酚以及三酚类化合物,对l-酪氨酸以及香草酸表现出较高的催化活性,此外BsPPO还对黑芝麻中含有的2-甲氧基肉桂酸、吲哚3-羧酸和根皮素表现出良好的催化活性。研究结果为黑芝麻多酚氧化酶酶学特性的明确奠定了理论基础。     

红树植物秋茄叶片双向电泳技术体系的建立及优化

对适用于秋茄(Kandelia candel)叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术体系进行了优化.结果表明,采用酚抽提法提取的蛋白质浓度较低,约1.7 μg μL-1,SDS-PAGE电泳后几乎无条带;而采用改良TCA -丙酮沉淀法可显著提高提取液中蛋白质的含量,可达12.4 μgμL-1.秋茄叶片蛋白质主要分布在pH4～...     

Unsaponifiable Matter Extraction From Chrysomya megacephala Oil

许多不皂化物成分作为药效成分被应用于恶性肿瘤的临床治疗中,五谷虫不皂化物的提取分离可以充分发挥这种传统中药材的功效.通过单因素实验得到不皂化物酸值较低而产率较高的最佳工艺条件是石油醚添加量为10 mL/g,碱添加过量5％,在60℃的条件下反应15 min,0.5 mol/L的KCl溶液添加量为50 mL/g.通过响应面优化后,得到最佳的不皂化物酸值和提取率分别为70.21 mg KOH/g和58.05％.     

原核表达的人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的活性及稳定性研究

对由原核载体表达的人乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2,简称ALDH2)纯化工艺、酶活性改善、稳定性以及保存条件分别进行了参数的优化,以期为ALDH2商品化剂型开发提供理论依据。通过NAD(P)+酶活测定法,检测不同纯化工艺、金属离子以及不同保存条件对ALDH2的酶活性的影响。通过SDS-PAGE检测ALDH2在模拟胃液和胰液中的稳定性。结果显示,低离子磷酸盐缓冲液透析有利于ALDH2酶活性的恢复,且真空冷冻干燥处理可导致ALDH2酶活性下降。K+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+均能提高ALDH2酶活性。ALDH2在模拟胃液中稳定性良好,但在模拟胰液中迅速被降解。与此同时,ALDH2酶液在-20℃下能良好地保持其稳定性及酶活,但在4℃和30℃下保存一个月酶活急剧下降。以上结果表明,低离子磷酸盐缓冲液透析法、K+均能提高ALDH2的酶活性,同时该酶可耐受模拟胃液的降解作用,且添加山梨酸钾的ALDH2于-20℃可良好地保持其稳定性及酶活。     

中华稻蝗谷胱甘肽S-转移酶的分离纯化

采用硫酸铵沉淀法和GSH-agarose亲和层析法,对中华稻蝗Oxya chinensis(Thunberg)5龄若虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)进行了分离纯化.结果表明:经硫酸铵沉淀,饱和度在60%-80%下沉淀中GSTs比活力较高,饱和度90%时比活力达到最高...     

莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体制备及应用

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究。方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,成功构建p ET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Western blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性。结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础。     

快速纯化重组腺联病毒的受体结合捕捉方法

【目的】建立用于重组腺联病毒(AAV)纯化的受体结合捕捉方法。【方法】将AAV受体的多囊肾病(PKD)结构域1和2与类弹性蛋白多肽(ELP)在重组大肠杆菌中进行融合表达,利用相变循环(ITC)纯化ELP-PKD融合蛋白;分别用昆虫和AAV-293细胞制备rAAV-GFP,与ELP-PKD融合蛋白共孵育后进行ITC,从沉淀复合物提取病毒DNA进行PCR检测;在优化条件下利用ELP-PKD蛋白结合捕捉rAAV-GFP,利用电子显微镜观察、免疫转印和细胞感染试验进行rAAV鉴定。【结果】ELP-PKD融合蛋白获得正确、可溶性表达,ITC纯化的蛋白纯度大于90%;ELP-PKD蛋白能特异结合rAAV-GFP,结合具有p H、温度和时间依赖性,受体结合捕捉方法可在1h内完成,从两种细胞纯化rAAV-GFP的回收率分别为58%和56%;rAAV-GFP洗脱具有p H和温度依赖性,洗脱rAAV-GFP的回收率分别为46%和44%;纯化rAAV-GFP具有AAV的典型形态和结构蛋白。【结论】建立的ELP-PKD结合捕捉法可用于不同细胞源rAAV的快速纯化。     

枯草杆菌BS-98分泌的抗真菌蛋白的分离纯化及其部分性质的研究

拮抗菌（Bacillussubtilis）BS-98菌株在BPY液体培养基中产生的蛋白质经硫酸铵分级盐析、SephsdexG-100柱层析、DEAE-纤维素柱层析和SephadexG－100柱再层析后,分离纯化得到的抗菌蛋白在电泳中显现出三条带。经初步纯化的抗菌蛋白对热稳定,对蛋白酶部分敏感。抑菌谱测定表明,抗菌蛋白对芦笋茎枯病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、灰霉菌、立枯丝核菌等病原真菌及黄瓜角斑病菌都具有强烈的抑制作用。