用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯

顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯（简称DHCD）是航天业、电子工业、医药业以及精细化工业上重要的手性化合物。利用重组E. coli JM109 (pKST11),采用适时监测发酵过程中全细胞甲苯双加氧酶（Toluene dioxygenase,TDO）活性的方法,研究了发酵生产DHCD工艺中的重要影响因子IPTG以及底物苯的供给方式对DHCD产量的影响。研究结果表明：（1）发酵初期利用IPTG诱导TDO的表达,不利于细胞生长,在对数生长中期（6或8h）,采用0.5mmol/L IPTG即可诱导出TDO的最高表达。（2）发酵液中的苯对全细胞甲苯双加氧酶(TDO)的活性有抑制作用,而利用液体石蜡作为缓释剂进行两相法发酵则降低了苯的毒害,明显提高了DHCD的产量。当采用传统的通气供苯方法,DHCD的产量仅有75 g/L;批式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量提高到226 g/L,是通气供苯法的3倍;而采用流加的方式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量进一步提高到368 g/L,是通气供苯法的5倍。证明通过发酵工艺的优化可以解决苯的毒害与苯作为反应底物在水相中需要有一定浓度之间的矛盾,获得较好的转化结果。     

人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ（hTopo Ⅰ）为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母（SMD-hTopoI）分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母（X33-hTopoI和KMhTopoI）更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY（pH 7.25）,于20℃,每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液,SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力（43000u/mL）,发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白,无糖基化修饰。     

紫杉醇及其产生菌的研究现状与展望

紫杉醇 (Paclitaxel,商品名Taxol)是一种二萜类衍生物 ,是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。1　紫杉醇的发现紫杉醇最早是于 1 971年 ,Wani等[1] 从短枝红豆杉 (Taxusbreviifolia)的树皮中分离得到 ,命名为紫杉醇。随后 ,Schiff等[2 ] 证实紫杉醇具有独特的抗癌机制 ,它作用于细胞微管 (Microtuble) ,通过与微管蛋白N端第 31位氨基酸和第 2 1 7～ 2 31位氨基酸结合 ,诱导和稳定微管蛋白聚合 ,抑制其解聚 ,增加聚合程度 ,使维管束不能与微管组织中心相互连接 ,将细胞周期阻断于G2 M期 ,导致有丝分裂异常或停止 ,阻止癌细胞增殖[3,…     

Flt3配体增强HCV核心 包膜E2融合基因DNA疫苗诱导的细胞免疫应答

建立一种可高效诱导细胞免疫应答,对丙型肝炎病毒（HCV）感染可能起预防和治疗作用的DNA疫苗。将小鼠Flt3配体（FL）信号肽和胞外段cDNA插入结构优化的HCV核心包膜E2融合抗原DNA疫苗pST-CE2t,构建成pST-CE2t/FL。将pSTCE2t/FL转染COS7细胞,Western blot和ELISA检测表明该重组质粒能表达HCV核心包膜E2融合抗原和可溶性小鼠FL。分别将pST-CE2t、pST-CE2t/FL和空载体pCI-neo肌肉注射接种BALB/c小鼠,检测小鼠的体液和细胞免疫应答。结果表明两种DNA结构均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答,但pST-CE2t诱导的体液免疫应答强于pST-CE2t/FL,而后者诱导的细胞免疫应答明显强于前者。FL能明显增强HCV核心包膜E2融合抗原DNA疫苗诱导的细胞免疫应答,对于发展HCV预防和治疗性疫苗有潜在的应用价值。     

王不留行多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究

通过单因素实验和正交实验,研究料液比、超声功率、超声提取温度和超声作用时间对王不留行多糖提取效果的影响。分别采用紫外分光光度法和邻苯三酚自氧化法测定其清除DPPH·和O-·2的作用进行试验,根据试验结果评价其体外抗氧化活性。得出优化工艺条件为:料液比(g∶m L)1∶50,提取温度60℃,超声功率100W,作用时间40 min。王不留行多糖的得率为9.60%,优选王不留行多糖的超声提取工艺,省时、高效、可靠、重现性好;体外抗氧化性试验显示王不留行多糖对DPPH·和O-·2具有较强的清除能力,且在一定范围内其抗氧化作用与浓度呈现良好的量效关系。     

在静态和动态培养条件下杂交瘤细胞的生长和代谢

通过对WuT3杂交瘤细胞在静态和动态培养条件下的比较,发现细胞生长和代谢有很大不同。在静态培养条件下,细胞培养周期较长,细胞密度较高;但在动态培养条件下,细胞代谢更加旺盛,葡萄糖、氨基酸等营养物质的消耗加快,乳酸、氨、丙氨酸等代谢产物的比生成速率较大。     

豆腐废水UASB反应器中的原核生物多样性及主要功能菌群

通过构建16S rRNA基因文库,对豆腐废水UASB反应器中颗粒污泥的原核生物多样性进行了分析,并用MPN法对颗粒污泥中的互养产乙酸细菌和产甲烷菌进行了活菌数量测定。结果表明,33%的16S rRNA基因序列属于产甲烷菌,氢和乙酸盐营养型的产甲烷菌在颗粒污泥中数量最多,分别为1.1×10.9个/mL和4.5×10.8个/mL。低GC革兰氏阳性菌和δ-变形菌纲分支的细菌也是颗粒污泥中的主要菌群,它们的16S rRNA序列分别占22%和9%,其中互养产乙酸细菌在颗粒污泥中的数量可达4.5×10.7个/ml。绿色非硫细菌是另一类丰度很高的细菌,其16S rRNA序列占文库的12%。对各类微生物在颗粒污泥中可能的作用进行了讨论。通过研究不仅了解了特定环境中的微生物组成,还为从中分离特异类群的微生物提供了指导。     

表达乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的二倍体酵母工程菌的选育

将乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的单倍体酵母工程菌Y19/YFD158和与其不同接合型的单倍体酵母菌Y95接合,筛选到二倍体酵母工程菌Y95xY19/YFD158。对两种工程菌的研究表明：二倍体工程菌发酵密度为单倍体工程菌的3倍;表达质粒在二倍体酵母中的稳定性明显高于单倍体工程菌;二倍体工程菌对融合抗原的表达量为单倍体的3倍以上;表达质粒在二倍体细胞中的平均拷贝数略低于单倍体工程菌。     

中国长白山乌苏里蝮蛇金属蛋白酶解整合蛋白Ussurin基因克隆和序列分析

采用Clontech链转换建库试剂盒,建立了中国长白山乌苏里蝮蛇毒腺cDNA文库,从中克隆了金属蛋白酶/解整合蛋白Ussurin,并进行了序列分析。结果显示,Ussurin开框读码序列由1434bp组成,编码478个氨基酸。由核苷酸顺序推导的氨基酸序列可以看出,Ussurin最初的翻译产物是酶原前体;依次含有18氨基酸组成的信号肽,171氨基酸组成的酶原区和由289氨基酸组成的Ussurin（200氨基酸组成的金属蛋白酶结构域、16氨基酸组成的间隔区和73氨基酸组成的解整合蛋白结构域）。Ussurin的金属蛋白酶结构域含有3对二硫键;解整合蛋白结构域含有6对二硫键和特征性RGD(精氨酸甘氨酸天冬氨酸)结构。其基因序列和结构域组成与GenBank中蛇毒金属蛋白酶/解整合蛋白呈现高度同源性属于P-Ⅱ。氨基酸序列blast比对发现,酶原区和解整链蛋白结构域呈现极高的同源性,而金属蛋白酶结构域却出现了极高的变异,推测这些变异结构区是为了适应不同的底物、不同受体或同一受体的不同结构域。     

麦长管蚜对E-β-法尼烯的嗅觉行为反应

【目的】测定麦长管蚜Sitobion avenae Fabricius对E-β-法尼烯(E-β-farnesene,EβF)矿物油溶液反应的最低阈值浓度,为EβF的田间应用提供依据。【方法】观察麦长管蚜3龄若蚜对不同浓度EβF的逃逸行为和"Y"型管嗅觉行为反应。每天定时分5次(9:00,11:30,14:00,16:30和19:00)滴加10μL EβF于滤纸上,滤纸用牙签固定于麦苗盆中心,持续处理5 d。每盆麦苗处理前接1龄若蚜15头。记录成蚜翅型及2周后蚜虫总数量。【结果】随着EβF浓度升高,麦长管蚜3龄若蚜3 min内逃离数显著增加,有翅蚜比例显著增加,种群个体数量显著下降,驱避效果明显增强。EβF浓度为200 ng/μL和≥600 ng/μL使蚜虫逃离数显著增加(P0.05)。"Y"型管选择行为测试结果表明,EβF≥600 ng/μL对3龄若蚜具有极显著的驱避作用(P0.01)。与对照相比,EβF≥600 ng/μL处理极显著提高了有翅蚜比例(P0.01);EβF≥400 ng/μL极显著抑制蚜虫种群个体数量增长(P0.01),但与600 ng/μL处理差异不显著。【结论】600 ng/μL EβF矿物油溶液为麦长管蚜驱避剂的最低阈值浓度。