应用亲和层析法提纯 鸡马立克氏病病毒pp38基因重组产物

利用鸡马立克氏病病毒(MDV)1型特异单克隆抗体H19致敏Sepharose 4B—cNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒pp38基因重组产物,获得良好效果。提纯的蛋白质在SDS—PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质条带也能被单克隆抗体H19识别。利用该提纯的重组pp38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病毒的昆虫细胞Sf9反应,也能和Ⅰ型MDV型感染的鸡胚成纤维细胞反应。     

青皮核桃采后病害生防菌贝莱斯芽胞杆菌XRD006全基因组分析及防治效果研究

【目的】探究生防菌贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis) XRD006对青皮核桃采后病害的生防能力及其贮藏保鲜效果,解析菌株的基因特性和次级代谢产物,了解菌株的抑菌机制。【方法】通过抑菌试验确定XRD006对青皮核桃采后病原菌的抑制能力。利用活体抑菌及贮藏试验探究生防菌对青皮核桃采后病原菌的抑制能力及对青皮核桃贮藏品质的影响。以全基因组测序了解菌株XRD006的基因组特征及潜在抑菌相关基因;利用antiSMASH软件预测XRD006的次级代谢产物;结合比较基因组学分析XRD006和贝莱斯芽胞杆菌标准株FZB42、SQR9之间的共线性关系和次级代谢产物基因簇差异。利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)和质谱鉴定XRD006次级代谢产物并通过牛津杯法测定其抑菌能力。【结果】抑菌试验表明菌株XRD006对青皮核桃采后病原菌隐秘刺盘孢(Colletotrichum aenigma)、暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和藤仓...     

高产杀粉蝶菌素的链霉菌鉴定及其拮抗水稻白叶枯菌活性研究

【目的】为保证农业生产可持续性发展,研发和使用环境友好的生物农药受到全社会的高度重视。微生物代谢产物农药是我国目前应用最广的生物农药,也是未来发展绿色农药的一个重要方向。【方法】利用包含水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) PXO99A的NA培养基琼脂平板,从水稻根际土壤中筛选能抑制Xoo生长的链霉菌。通过高效液相色谱和质谱分析活性代谢产物的化学结构;采用剪叶法接种Xoo到水稻叶片后,再喷施杀粉蝶菌素溶液(0.1 g/L),2周后测定叶枯症状;采用响应面分析法优化高产杀粉蝶菌素的发酵培养基;采用PacBio SMRT测序平台+Illumina HiSeq X Ten平台开展全基因组测序。平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)用于比较HSW2009与其他链霉菌在全基因组水平的亲缘关系。【结果】分离到一株对Xoo生长有强抑制活性的链霉菌HSW2009,其活性代谢产物为杀粉蝶菌素A1(piericidin A1,简称PIE);喷施PIE可以减轻Xoo在水稻叶片内的侵染;优化HSW2009高产PIE的发...     

撕裂蜡孔菌HG2011对光叶紫花苕结瘤固氮的影响及其潜在机制

【目的】 在我国南方尤其是西南地区,光叶紫花苕(Vicia villosa Roth.)作为重要的青饲和绿肥两用豆科作物被广泛种植,有助于提高土壤氮素和后茬作物的产量品质。接种有益微生物是促进豆科作物生物固氮和生长的重要措施之一。为此,本文研究了一株自主分离获得的白腐真菌¾¾撕裂蜡孔菌(Careporia lacerata HG2011)对光叶紫花苕结瘤固氮和生长的影响,并揭示其潜在机制。【方法】 采用微生物培养、植物培养和田间试验,研究C. lacerata磷铁活化能力、代谢产物构成、与根瘤菌Rhizobium sophorae S3的相互作用,及其对光叶紫花苕结瘤、生长、产量、品质和土壤有效磷铁的影响。【结果】 C. lacerata和根瘤菌之间无拮抗作用。液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)分析发现,C. lacerata发酵液含有氨基酸、有机酸和类黄酮等化感物质,能增强根瘤菌的趋化性并促进生物膜形成。此外,C. lacerata还能释放生长素、赤霉素、水杨酸和铁载体,活化难溶性有机和无机磷。在植物培养试验中,单独接种C. lacerata或根瘤菌均能促进光叶紫花苕生长,但以共接种处理效果最佳。C. lacerata定殖于光叶紫花苕根际,导致根长、根系表面积和结瘤数显著增加。田间试验发现,接种C. lacerata显著提高了光叶紫花苕单株根瘤数、根瘤质量和固氮酶活性,以及土壤有效磷铁含量和磷酸酶活性,产量比常规施肥处理增加12.15%且品质无显著变化。【结论】 C. lacerata能够在光叶紫花苕根际定殖,通过分泌化感物质、生长素和活化土壤磷铁等机制促进结瘤固氮和生长发育。C. lacerata易于培养,菌剂制备成本低廉,施用简便,对提高豆科作物产量品质具有一定应用价值。     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。     

喙尾琵琶甲肠道来源链霉菌(Streptomyces sp.)BPA71次级代谢产物的分离鉴定及其生物活性评价

【背景】昆虫是世界上种类最多、肠道菌群资源最丰富且多样的动物类群之一。昆虫肠道微生物具有产生活性次级代谢产物的能力,是活性天然产物的重要来源。【目的】研究药用昆虫喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera)成虫肠道来源链霉菌(Streptomyces sp.) BPA71的次级代谢产物及其生物活性。【方法】利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱等方法分离纯化该菌株的发酵粗提物,采用牛津杯法进行抗菌活性追踪,确定抗菌活性部位,通过ESI-MS、NMR等波谱数据分析对化合物结构进行鉴定,采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),采用MTS法测定抗肿瘤活性。【结果】从Streptomyces sp. BPA71的固体发酵提取物中共分离得到4个已知化合物,通过对比核磁数据确定为糠酸甲酯(1)、吡咯甲酰胺A (2)、吡咯甲酰胺B (3)和吲哚-3-乙酸甲酯(4)。抗菌活性结果显示化合物2具有广谱抗菌活性。此外,化合物2对宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞SW480这5株肿瘤细胞均有明显的抑制活性。【结论】喙尾琵琶甲肠道来源Streptomyces sp. BPA71可产生丰富的生物活性物质,该研究结果为进一步挖掘喙尾琵琶甲肠道链霉菌的活性天然产物奠定了基础,同时丰富了人们对喙尾琵琶甲肠道微生物的认识。     

多酶恒温扩增核酸试纸条法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

【背景】肺炎支原体是导致儿童和青少年呼吸道感染的重要病原体,长期以来由于其临床表现不特异而容易错过最佳治疗时期。【目的】结合多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)技术和核酸试纸条建立一种快速检测肺炎支原体的方法。【方法】以肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征(community acquired respiratory distress syndrome, CARDS)毒素编码基因为靶基因设计引物和探针,对反应体系的温度、时间等进行优化,评估其敏感性,通过检测肺炎支原体和其余7种病原体分析其特异性,并对35份临床样本进行验证。【结果】MIRA核酸试纸条法在37℃条件下,15 min内便可完成对肺炎支原体的检测,最低检出限为10 copies/μL;除肺炎支原体外,其余7种病原体均不能扩增,特异性较好。以实时荧光PCR检测为标准,MIRA核酸试纸条法对35份临床样本检测后的诊断特异度为100.00%、灵敏度为96.15%、阴性预测值为90.00%、阳性预测值为100.00%。【结论】本研究建立了MIRA核酸试纸条法...     

防治平贝母菌核病的木霉菌筛选及室内防效

【背景】由病原菌Sclerotium denigrans侵染引起的平贝母菌核病是其主要的鳞茎病害之一,给平贝母种植产业带来了巨大的损失。【目的】筛选出对平贝母菌核病具有拮抗效果的木霉菌株。【方法】以平贝母菌核病作为靶标菌,采用平板对峙试验、平板对扣法、圆盘滤膜法与发酵液抑菌试验筛选对平贝母菌核病具有拮抗效果的木霉菌株。采用顶空固相微萃取的方法检测拮抗效果较好的木霉菌挥发性成分;二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid, DNS)比色法测定木霉菌的β-1,3葡聚糖酶的活性;室内防效试验验证其对平贝母菌核病的防治效果。【结果】平板对峙试验发现木霉菌F1、F2和D6对平贝母菌核病菌的生长具有较强的抑制作用,其抑菌率分别为91.06%、87.00%和86.12%;平板对扣法发现木霉菌E17和A26对菌核病菌的抑制效果最为明显,抑菌率分别为74.96%和75.86%;圆盘滤膜法发现菌核病菌在F2、C6、D3、F4、A26、B30、D4和D6的琼脂培养基上均不生长,抑菌率达100%;发酵液抑菌试验表明木霉菌D3抑制效果最强,可完全抑制菌核病菌的生长,抑菌率为100%;对A26、D4、E8、E17和D3这5株木霉进行GC/MS挥发性产物分析,在E17发现了具有抗真菌活性的6-戊基-2H-吡喃-2-酮等活性物质;DNS比色法发现β-1,3葡聚糖酶活性最高的木霉菌为F1;室内防效试验测定发现D3能明显抑制平贝母鳞茎菌核病的病变,对平贝母菌核病具有潜在的生防活性。【结论】木霉菌D3在防治平贝母菌核病中是极具开发价值的菌种。     

热浪岛珊瑚礁泥砂真菌多样性及真菌Cladosporium sp. GXIMD02067天然产物分离与鉴定

【背景】海洋沉积物真菌富含生物活性天然产物,但珊瑚礁泥砂真菌及其天然产物的研究较少。【目的】分离珊瑚礁泥砂真菌及其天然产物,探究珊瑚礁泥砂来源真菌多样性,为海洋真菌天然产物开发奠定基础。【方法】采用稀释涂布平板法分离马来西亚热浪岛珊瑚礁泥砂真菌并基于ITSrDNA序列分析鉴定真菌;综合运用硅胶柱、反相柱和制备HPLC色谱技术分离枝孢属真菌(Cladosporium sp.) GXIMD02067的天然产物,通过核磁共振波谱技术和文献数据比对鉴定化合物结构。【结果】19株真菌被分离,隶属1纲4目4科6属,包括7株曲霉属(Aspergillus)、6株青霉属(Penicillium)、2株枝孢属(Cladosporium)、1株蜡蚧菌属(Lecanicillium)、2株路霉属(Lulworthia)和1株Parengyodontium。GXIMD02065和GXIMD02066 ITS rDNA序列的相似度小于87%,是潜在新菌种。7个化合物从Cladosporium sp. GXIMD02067中分离并鉴定为pyrenocine A (1)、pyrenocine B (2)、胸腺嘧啶脱...     

支链氨基酸及代谢中间产物对胰岛素抵抗的调控及其机制

支链氨基酸作为必需氨基酸,可用于合成含氮化合物,也可充当信号分子调节物质代谢。研究表明,支链氨基酸水平升高与胰岛素抵抗和2型糖尿病发生密切相关,其可通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路来影响胰岛素信号转导,还可通过损害脂质代谢和影响线粒体功能来调控胰岛素抵抗。此外,支链氨基酸分解代谢异常会导致代谢中间产物(如支链α-酮酸、3-羟基异丁酸和β-氨基异丁酸等)积累,其中支链α-酮酸和3-羟基异丁酸可通过影响胰岛素信号通路、损害脂质代谢等来诱发胰岛素抵抗,而β-氨基异丁酸可通过减少脂质积聚和炎症反应、增强脂肪酸氧化等来改善胰岛素抵抗。本文系统综述了支链氨基酸及其代谢中间产物对胰岛素抵抗的影响及调控机制,以期为胰岛素抵抗和2型糖尿病的防治提供新方向。