海洋低温蛋白酶菌株选育及发酵培养基的研究(I)

以渤海和黄海分离出400多株在低温条件下生长良好的菌株为出发菌株,利用常规筛选方法选出2株低温蛋白酶产生菌(Pseudom onas alcaligenes)。经UV、DES、NTG、EMS、L iC l单独及复合诱变,选育出一株(Pa040523)蛋白酶高产突变株。通过单因素实验,确定了Pa040523菌株蛋白酶发酵培养基为:玉米淀粉糖1.8%,尿素0.6%,磷酸氢二钾0.6%,磷酸二氢钾0.3%。该突变株低温蛋白酶产量为940.8 U/mg。     

整合型碱性蛋白酶基因工程菌中抗性基因的敲除*

要：利用大肠杆菌载体pET—韶a和穿梭载体PHY3肋队构建了敲除载体p10c,通过DP4A变性技术和同源重组技术成功地敲除了整合型碱性蛋白酶基因工程茵BP旧1中的卡那霉素抗性基因(M),得到11株敲除卡那霉素抗性基因的阳性克隆,并使产酶水平保持稳定。该方法的建立为基因敲除技术在工业微生物研究中应用提供了经验,并为微生物来源的转基因产品安全性的研究提供了模型。     

蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌α－淀粉酶活力的影响

目前工业生产α－淀粉酶的主要菌种是解淀粉芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）,该菌在培养条件下不但产生α－淀粉酶,同时也产生一定比例的蛋白酶。本文研究了不同来源的蛋白酶对解淀粉芽孢杆菌ＢＦ７６５８和８６３１５α－淀粉酶活性的影响,结果发现中性蛋白酶对两种α－淀粉酶活性无显著影响,而２７０９碱性蛋白酶能使α－淀粉酶活性丧失６０％以上。     

嗜冷性海洋微生物产蛋白酶的研究

从210株海洋细菌中筛选出30株产蛋白酶活力较高的菌株。以N₁为出发菌,用UV诱变处理,获得突变株。其中的N_1-3。菌株最适生长温度为20℃;在21℃下培养44小时,产酶最高。酶反应最适温度为50℃,最适pH8.0。30℃以下酶活稳定。     

毛霉蛋白酶的研究

蛋白酶是食品工业中最重要的加工配料(辅料)之一,蛋白酶在食品加工中的应用主要是利用了其对蛋白质所产生的多样化水解作用[1-2]。许多受人欢迎的食品,如干酪、啤酒和酱油等的生产过程都包含蛋白酶催化蛋白质水解这一关键性的反应。对这些食品加工技术的改进体现在,基于对这些加工过程所涉及的各种     

TMPRSS2重组蛋白阻断SARS-CoV-2假病毒的感染

为了探究Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(type II transmembrane serine protease, TMPRSS2)重组蛋白阻断严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)侵染宿主的能力,在体外构建假病毒感染细胞的体系,使用SARS-CoV-2 S (spike glycoprotein)蛋白携带水疱性口炎病毒(ΔG-VSV/荧光素酶)感染细胞,利用293F细胞体外纯化酶活及自身剪切位点突变的TMPRSS2重组蛋白,发现纯化的剪切位点R255Q和酶活位点S441A双突变的TMPRSS2重组蛋白,能够有效降低S蛋白与宿主细胞表面TMPRSS2的结合,进而阻断SARS-CoV-2假病毒对Calu3肺癌细胞系的感染。实验结果表明,使用突变的TMPRSS2重组蛋白竞争性结合病毒的刺突蛋白S,同抑制TMPRSS2蛋白酶的活性一样,都能阻断S蛋白的切割活化,抑制病毒与宿主细胞的膜融合,最终达到阻止病毒入侵的目的,这为阻断SARS-CoV-2感染提供了新的潜在靶点和思路。     

紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株

以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株,以这些菌株产蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶、糖化酶)活力大小为评价标准,筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。将米曲霉Y29菌株应用于黄豆酱的生产中,并与目前工业生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042菌株进行比较。性能实验结果表明米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标两者的差异并不显著;制酱品质试验结果表明,米曲霉Y29菌株的酱香更浓郁一些,氨基酸态氮含量达到0.77g/100mL,高于米曲霉沪酿3.042菌株,其它指标均符合国家标准GB2718-1996。     

N+离子注入诱变选育中性蛋白酶高产菌株及发酵条件的研究

对产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AS1.398进行离子注入诱变,从正突变率较高的注入剂量30～50 × 1014 ions/cm2范围内,筛选出一株高产菌株ZC-7.该菌株在优化了的摇瓶培养基中,培养42h,产酶可达16900U/mL.在7L发酵罐上控制pH6.0～7.0,溶氧10%～20%.以32℃3～40℃～30℃变温发酵42h,酶活力最高可迭19680U/mL,为初始菌株的2.1倍.     

基于密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化

【目的】提高蛋白酶K在毕赤酵母中的表达产量,建立分离纯化方法。【方法】首先对蛋白酶K密码子进行优化,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达。然后对甲醇浓度、发酵温度和p H等表达条件进行优化,再对硫酸铵沉淀、亲和层析等纯化工艺进行比对分析。【结果】蛋白酶K密码子优化后实现了在毕赤酵母中的高效表达。在甲醇量0.75%、温度25°C和p H 7.0条件下进行发酵罐培养,蛋白酶K表达量达到2.2 g/L。采用Ni-NTA亲和柱对发酵液进行纯化可以得到较好的纯化效果。【结论】密码子优化后的蛋白酶K在毕赤酵母中高效表达并可以利用Ni-NTA亲和柱进行有效分离纯化。     

侧孢短芽孢杆菌AMCC 100017的分离鉴定及其生防潜力

【目的】从土壤中分离、筛选和鉴定具有抑制病原真菌活性等生防效果的菌株,为进一步开发利用具有良好定殖能力的生防菌株奠定基础。【方法】利用对峙试验筛选拮抗菌并评价其拮抗性能,根据其形态特征、生理生化特性、16S r RNA基因序列测定及Gen Bank序列相似性分析进行分离菌株的分类鉴定,并通过福林酚法测定该菌株的蛋白酶活力。【结果】从山东泰安各种类型土壤中分离得到侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),保藏编号为AMCC100017。平板对峙试验结果表明该菌株对多种植物病原真菌均有较强的拮抗作用,尤其是对镰刀菌属致病菌拮抗效果明显。另外,本试验还初步验证该菌能产生较高活性的胞外蛋白酶。【结论】侧孢短芽孢杆菌AMCC 100017在作物真菌病害生物防治方面,有较好的开发和利用潜力,并可望应用于线虫生物防治。