2021—2022年山东生物学等级考试有关PCR考查的分析及教学启发

新高考对基因工程的考查体现出情境新颖、信息量大、区分度高等特点。本文对2021—2022年山东生物学等级考试第25题基因工程试题中,有关聚合酶链式反应（PCR）扩增过程中引物的设计、限制酶的选择等问题进行分析,并反思今后有关基因工程内容的教学。     

基于rDNA ITSl和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱 Nilaparvata lugens、白背飞虱 Sogatella furcifera 和灰飞虱Laodelphax striatellus 的rDNA ITSl和ITS2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法.3种飞虱的ITSI和ITS2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大.ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个,ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个.根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想.而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带.因此,采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定.     

毛细管电泳四色荧光检测法分析茶树SSR标记

将毛细管电泳四色荧光栓测技术应用于茶树SSR标记分析.该方法采用三引物PCR扩增SSR位点,三引物即在5'端加有M13尾巴序列(5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3')的特异正向引物、特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物:为了运用四色荧光检测系统使通过一次毛细管电泳能同时检测3个以上的SSR位点,采用蓝、绿、黑3种不同颜色的荧光染料分别对3个M13引物进行标记. 应用该方法对42个茶树品种(系)的16个SSR位点进行遗传分析的结果表明:此法具有简便、可靠、低成本及高通量的优点;且随着所分析SSR位点数的增加,降低成本的效果更加显著.采用建立的方法,还筛选获得了11个多态性丰富的可应用于茶树遗传研究的SSR标记.     

植物叶绿体与线粒体基因组DNA特异性比较研究

研究不同植物间叶绿体和线粒体基因组DNA的差异,探讨其在法庭科学中的应用价值.根据叶绿体和线粒体基因组DNA核苷酸序列的特点,分别设计了一系列相应的引物,经PCR扩增后,电泳鉴别不同的植物.结果表明在设计的一系列引物中,叶绿体基因组DNA的PCR产物差异不大,鉴别效果不明显;而线粒体基因DNA的PCR产物差异大,鉴别效果明显.因此以线粒体DNA为模板进行PCR扩增,在不同植物间存在良好的差异性,适合于不同植物间的鉴别,在法庭科学中具有实际应用价值.     

基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源北大核心CSCD

α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。     

DNA纤维上的原位杂交技术

ＤＮＡ纤维上的荧光原位杂交（Ｆｉｂｅｒ－ＦＩＳＨ）技术是一种非重要的分子细胞遗传学技术。对于高分辨物理图的绘制、基因组和染色体结构的研究、致病基因的定位克隆等都有很大作用,本文介绍了该技术的基本操作和应用,以及与引物原位ＤＮＡ合成（ＰＲＩＮＳ）等技术相结合进行更精确基因定位的潜力。     

用整合微流控芯片系统分析黄山松RAPD片段多态性

随机扩增多态DNA（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）标记可快速提供连锁信息,特别是在针叶树单倍体的大配子体中RAPD基因型也能得以确定［3］。在对多态性的RAPD片段进行分析时,传统的平板凝胶电泳分析法因人工操作,其有效的鉴别受到一定程度的限制,只能得到一些有关RAPD片段半定量信息。我们将整合微流控芯片系统作为一种新的工具运用于黄山松的多态性RAPD片段分析中。发现基于芯片的检测方法比琼脂糖凝胶电泳方法灵敏度更高,所需的样品量要少得多,所需的时间仅为其1/4。并且能自动对DNA片段进行定性、定量分析。它是一种高效、灵敏、迅速、重复性好的检测新技术。 Abstract:Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers quickly provide linkage information［1~2］,especially in conifers where haploid megagametophytes can be used for genotyping［3］.Traditionally use of slab gel electrophresis results in qualitative data that can be manually manipulated to gain semiquantitative information about the polymorphic RAPD fragments.We have proposed the use of an integrated microfluidic chip-based system as a new tool in the analysis of polymorphic RAPD fragments.The chip-based method was found to be very sensitive,requiring much less sample and only quarter the time compared to the agarose gel method.The automated data analysis sizes and quantitates the DNA fragments,thus yielding a more thorough,reproducible,sensitive,and rapid analysis.     

小菜蛾羧酸酯酶基因的克隆及其序列分析

利用CODEHOP设计简并引物,通过反转录多聚酶链式反应(RTPCR)克隆小菜蛾Plutellaxylostella抗性种群中抗性相关的羧酸酯酶基因,随机挑取测序5个阳性克隆进行测序,测序结果经过blastx比较,发现所获得的大约420bp的基因片断均为羧酸酯酶基因,与双翅目昆虫蚊子的氨基酸序列同源性达85%以上 。     

蹄盖蕨科DNA的提取和几种因素对RAPD分析的影响

以黑龙江省牡丹江市4种蹄盖蕨科植物为材料,对其DNA提取及RAPD分析进行了研究,分别测试了模板浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度、dN TP浓度,确定适合蕨类植物DNA提取和RAPD分析的较理想的扩增条件,为RAPD分析应用于蹄盖蕨科遗传多样性研究打下良好基础。     

等位基因特异性引物PCR技术及其应用研究

目的：研究建立等位基因特异性引物PCR技术体系,并将其应用于基因单核苷酸多态性研究工作。方法：通过美国国家生物信息中心(NCBI)的genBank获取基因序列及其相应位点的SNP信息。利用Primer5．0软件设计引物,并经NCBI的Blast2．0软件检验其特异性。结果：建立了单一等位基因特异性引物PCR(SASP—PCR)与嵌套式等位基因特异性引物PCR(NASP-PCR)两种技术,并应用于β2肾上腺素受体及内皮源性一氧化氮合酶基因单核苷酸多态性的研究,证实该技术的稳定性和优越性。结论：等位基因特异性引物PCR技术是一种更为简便、特异性较高、费用少的、便于推广的SNP检测方法,特别是在群体基因单核苷酸多态性研究中更有优势。