水稻谷胱甘肽过氧化物酶基因OsGPX3 和OsGPX4的分子特性研究

植物谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)是清除体内活性氧的一种关键酶,在植物抗逆反应中发挥重要作用.本研究从水稻中克隆到2个GPX基因,分别为OsGPX3和OsGPX4.OsGPX3和OsGPX4分别编码238和234个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量分别是25.84 kD和25.07 kD.两个基因都包含5个内含子,但是两个基因所对应的内含子长度具有较大变异.组织表达谱分析发现这2个基因在根、茎、叶和叶鞘中均表达,是组成型表达基因.在大肠杆菌中表达并纯化了这2个基因的重组蛋白,酶活性分析显示OsGPX3和OsGPX4蛋白对底物H₂O₂、tBOOH和COOH具有较高活性,但是OsGPX3对3种底物的活性均高于OsGPX4,蛋白质酶活性的差异预示着这2个基因可能存在功能上的分化.     

Over-expression of fibroblast activation protein alpha increases tumor growth in xenografts of ovarian cancer cells

Fibroblast activation protein alpha （FAPα） is a 95-kDa serine protease of post-prolyl peptidase family on cell surface. FAPoL is widely expressed in tumor microenviron- ment. The wide spread association of FAPα expression with cancer suggests that it has important functions in the disease. However, the nature of FAPα＇s roles in cancer cell activity is not well-determined. It has been showed that FAPα silencing in SKOV3 cells induces ovarian tumors but significantly reduces tumor growth in a xenograft mouse model. To further determine the role of FAPoL in epithelial ovarian cancer cells, SKOV3-FAPα and HO8910-FAPα cell lines, which over-expressed FAPα stably, were con- structed and then their biological behaviors were investi- gated. It was found that FAPoL promoted ovarian cancer cell proliferation, drug resistance, invasiveness, and migra- tion in vitro. Immunochemistry assay showed that FAPα significantly facilitated tumor growth in xenograft tumor tissues. These results suggested that FAPα might directly promote tumor growth and invasiveness in ovarian cancer cells.     

单细胞技术在干细胞研究中的应用

干细胞是具有自我更新和分化潜能的异质性细胞群体。基于细胞群体水平的干细胞研究不能满足深入认识干细胞生物学本质及实际应用的需要。近年来,单细胞相关技术不断发展和成熟,并正在干细胞基础研究及其相关领域中获得迅速应用。该文以造血干细胞为主要例举,就实验研究中常用的单细胞分离、单细胞克隆分析、单细胞移植、单细胞实时定量PCR及单细胞测序等技术原理及其应用进行综述。     

蛇足石杉内生真菌Shiraia sp. Slf14中赖氨酸脱羧酶基因的克隆、表达及功能

【目的】阿尔茨海默症治疗药物石杉碱甲(Huperzine A,Hup A)的生物合成途径起始于赖氨酸脱羧酶(Lysine decarboxylase,LDC)。本研究克隆及表达了来源于产Hup A的植物内生真菌的LDC基因,并研究了其功能。【方法】采用RT-PCR扩增法,从一株产Hup A的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14获得LDC基因,构建表达质粒p ET-22b-LDC与p ET-32a-LDC,转化感受态细胞E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为1×10~(–3) mol/L,于24°C、200 r/min培养8 h,诱导表达LDC蛋白质;通过Ni~(2+)金属亲和层析纯化重组LDC并建立酶促反应体系,利用TLC检测了LDC催化活性。利用生物信息学软件分析了LDC的理化性质及蛋白质的空间结构。【结果】成功克隆并异源表达出重组蛋白LDC与Trx-LDC,经SDS-PAGE电泳鉴定分子量分别为24.4 k Da和42.7 k Da,与预计大小相符。TLC结果表明LDC与Trx-LDC均具有赖氨酸脱羧酶活性。【结论】本研究从产Hup A的蛇足石杉内生真菌Shiraia sp.Slf14中成功克隆到LDC基因并进行了异源表达,检测到了其催化活性,为丰富LDC分子信息及阐明内生真菌中Hup A生物合成机制提供参考数据。     

家蝇溶菌酶MDLZM2基因的克隆、序列分析及原核表达

对家蝇溶菌酶(Musca domestica lysozyme,MDLZM2)基因进行克隆、序列分析,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从Gen Bank家蝇基因组中筛选获得MDLZM2基因。以该基因的序列设计引物,进行PCR扩增,测序分析获得该基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和保守结构域等方面进行预测和分析。构建p EASY-E1-MDLZM2重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S Chemically Competent Cell中进行诱导表达及纯化。结果表明MDLZM2基因ORF全长552 bp,编码183个氨基酸,理论分子量21.2 k Da;等电点为6.13,具有Lysozyme家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达p EASY-E1-MDLZM2并诱导表达、纯化重组蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

异质性水分环境中克隆整合对活血丹生物量分配及叶片结构特征的影响

喀斯特石漠化环境有着高度的生境异质性,异质性生境中土被不连续,土壤瘠薄,岩溶漏斗上的土壤保水性差,严重制约着喀斯特植被的生长及分布。为探究克隆植物在喀斯特地区的适应策略,本研究以喀斯特黄色石灰土为基质,选用克隆植物活血丹（Glechoma longituba）,以一个节间连接的两个分株为材料,保持节间连接或切断,种植于相邻花盆中,并施以不同浇水量,以明确不同水分可用性水平下克隆整合对活血丹生物量积累、生物量分配、叶片气孔及叶片组织特征的影响。结果显示,克隆整合显著促进活血丹生物量的积累及对根、叶的生物量分配;增加了活血丹叶气孔导度,降低了气孔指数;叶海绵组织受克隆整合影响较小,但栅栏组织及栅海比（栅栏组织/海绵组织）表现为非整合分株高于整合分株。本研究表明,克隆整合可增加活血丹胁迫分株对根、叶的投资,并以更佳的叶气孔、组织适应策略提高其在喀斯特生境中的生存与适应。     

广西红壤土壤微生物溶磷基因的克隆与表达

本研究对广西红壤土壤微生物溶磷基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从广西红壤中提取宏基因组DNA,克隆了GabY基因,构建大肠杆菌原核表达载体p ETDuet-1,转化大肠杆菌DH5α得到重组工程菌。通过酶切验证重组体。重组体在诱导条件下24 h对难溶矿物质磷Ca_3(PO_4)_2的溶磷量为(40.73±1.32)μg/mL,而对照组仅为(5.11±0.08)μg/mL。重组体和对照随着诱导时间的增加,培养基pH值均有下降趋势,但重组体培养基pH值变化显著大于对照组,产酸能力显著优于对照组。证明成功克隆得到土壤微生物溶磷基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

3种杓兰属植物菌根真菌系统发育和多样性分析

兰科植物菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi, OrMF)在兰科植物种子萌发和后续生长发育过程中具有重要作用。该研究采用培养(菌丝团分离)和非培养(克隆文库)2种方法获得同一栖息地3种不同杓兰属植物根中菌根真菌ITS序列并划分可操作分类单元(Operational taxonomic units, OTUs),分析其系统发育关系和多样性。结果表明:(1)所有根段中都有菌丝团定植,共分离出菌根真菌64株,其中63株为胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌,1株为角担菌科(Ceratobasidiaceae)真菌;可划分为7个OUT,每个OTU代表菌株的菌丝都能形成OrMF典型的近球形或椭球形链状排列的念珠状细胞;分离出来的菌根真菌均为无性型菌丝且不产生无性孢子。(2) 非培养法得到的3种杓兰属植物的根中OrMF分别隶属于胶膜菌科(Tulasnellaceae),腊壳菌科(Sebacinaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)和革菌科(Thelephoraceae),其中胶膜菌科OTU在种类和数量上占有绝对优势,培养和非培养2种方法得到的OrMF OTU类型和数量均为西藏杓兰(Cypripedium tibeticum)>无苞杓兰(C. flavum)>黄花杓兰(C. bardolphianum),但培养法少于非培养法。(3)对胶膜菌进行系统发育分析显示,优势和非优势OTU均分布在系统发育树的3个不同分支上,这种与多种亲缘关系较远的OrMF共生的现象可能与杓兰属植物对环境的适应性有关,且不同杓兰的OrMF物种丰富度没有显著差异,但群落结构存在差异。     

基于PIPE现象的质粒克隆位点序列设计与功能评价

分子克隆是现代生物学研究的核心技术之一,是基因工程、蛋白质工程中的重要手段。为提高分子克隆实验的操作效率,本研究设计并合成基于聚合酶引物不完全延伸（polymerase incomplete primer extension,PIPE）现象的质粒克隆位点序列。并以此为基础统一相关引物的设计方案,避免传统酶切--连接法中需针对不同载体MCS序列设计不同引物的缺点。该方案利用13 bp定长接头序列,在同一体系中使用2对引物、2种线性化模板同时扩增载体和插入片段,通过20个循环,在1次PCR过程中即合成可供转化使用的带缺口质粒产物。在NEB Q5酶系统中,利用此法将3种荧光素酶序列插入pET-15b及pET-21b(+)载体,均获得成功。且利用商品化感受态细胞（转化效率 > 5×108 cfu/μg）转化后所获得转化子数量均在300个以上,其中含插入片段的阳性克隆比例可达85%以上。基于本方案的设计及作用原理,可将其应用于10 kb以内载体和插入片段的快速重组。且具有通用性强、耗时少、阳性克隆得率高和成本低等优点,是传统DNA重组方法的有益补充,可作为各实验室的常规分子克隆手段之一。     

紫色马铃薯花青素StAN1基因的克隆及功能分析

MYB是植物花青素合成代谢途径中最主要的转录因子。该研究以紫色马铃薯B-5为试验材料,通过同源克隆技术,克隆了马铃薯花青素StAN1基因,并对StAN1基因的表达、遗传转化及其转基因烟草的花青素含量进行分析。结果表明:(1)StAN1基因全长774bp,编码了258个氨基酸;系统进化树分析发现,StAN1与辣椒、茄子、芦竹的亲缘关系最近,与矮牵牛、苹果等的亲缘关系最远。(2)荧光定量PCR分析显示,StAN1基因在马铃薯不同组织均有表达,其表达量从小到大依次为:根叶茎匍匐茎薯皮薯肉。(3)成功构建了表达载体pJAM1502-AN1,并经农杆菌(Gv3101)转化获得根、茎、叶片及叶脉均为紫红色的转StAN1基因烟草,PCR鉴定表明目的基因StAN1已成功转入烟草中。(4)花青素含量分析表明,野生型烟草叶片中花青素含量为2mg/g,叶片颜色为绿色,而转StAN1基因烟草叶片花青素含量达20mg/g,叶片颜色变成了紫红色。