一株牛源阿卡斑病毒的分离鉴定

阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)是能引起牛、绵羊、山羊流产、早产、新生胎儿畸形的虫媒性RNA病毒。为了解家畜虫媒病毒在我国西南边境地区的分布和流行情况,本研究对中缅边境西盟县的52份牛抗凝血和140份血清(牛70份、羊70份)中的蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、鹿流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)、AKV等虫媒病毒进行检测与分离,通过ELISA及qRT-PCR方法检测病毒,通过核酸阳性抗凝血接种BHK细胞传代以分离病毒,通过设计特异性引物,扩增分离毒株S基因721bp片段及M基因816bp片段,通过克隆测序及中和试验以鉴定病毒,最终从38号牛的抗凝血中分离到一株AKV,TCID50为10-3.5/0.1mL,经比对,分离株S片段与日本KS-2/Mo/06毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%。本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到AKV,证实了西南边境存在AKV的流行,为AKV在我国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。     

血管生成素发展史北大核心CSCD

1985年 Bert L．Vallee等发现血管生成素,并明确其基因和蛋白质序列1986年 明确血管生成素属于核糖核酸酶A超家族1987年 明确血管生成素在细胞系、人体正常和肿瘤组织中mRNA的丰度重组表达血管生成素蛋白。     

广西麻鸡FOXL2基因的克隆、序列分析及在高低产蛋量卵巢中的表达

为了研究鸡FOXL2基因的结构和功能,本研究克隆了广西麻鸡FOXL2基因编码区序列,分析了其突变位点及与其他物种的同源性和进化距离,以及在高产组和低产组母鸡卵巢组织中的表达水平.结果 表明:广西麻鸡FOXL2基因的编码区长度为918 bp,共编码305个氨基酸,存在一处错义突变和两处同义突变.通过物种间的同源性分析显示,广西麻鸡FOXL2基因与原鸡(Gallus gallus)、雉鸡(Phasianus colchicus)、绿头鸭(Anas platyrhynchos)、野鸽(Columba livia)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)的同源性分别为99.7％、98.8％、95.1％、92.0％、75.7％、75.5％.通过种间进化树分析表明,广西麻鸡与原鸡(Gallus gallus)的亲缘关系最近,与小鼠(Mus musculus)的亲缘关系最远.FOXL2在高低产蛋量鸡卵巢中的表达水平结果显示:FOXL2基因在高产蛋组中的表达量显著高于低产蛋组中的表达量(P＜0.05).该研究结果提示鸡FOXL2的序列相对较保守,对卵巢功能的维持和提高产蛋量具有功能性作用.     

HEPIS的表达谱及其在直肠癌中的表达分析

HEPIS是一个新基因,关于HEPIS的表达和功能尚不十分清楚.本研究首先构建了HEPIS的表达载体pEGFP-C3-HEPIS,采用双荧光素酶报告实验检测了 HEPIS对Wnt、CRE、NF-KB和HRE信号通路的作用,随后采用RNA原位杂交(RISH)检测了 HEPIS在12种不同器官(乳腺,结肠,食道,肾,肝,肺,卵巢,胰腺,前列腺,直肠,胃和宫颈)的癌组织和正常组织的表达差异,并且检测了 HEPIS在40例直肠腺癌和直肠正常组织的表达.研究表明,在293T细胞转染pEGFP-C3-HEPIS后,无论是转录水平还是翻译水平,HEPIS均显著增加,且HEPIS可以显著抑制Wnt、CRE和NF-KB 3条信号通路,对NF-κB信号通路的抑制最为显著.RNA原位杂交实验证实HEPIS在12个器官的癌组织和正常组织中表达存在明显的表达差异.采用GEPIA对HEPIS在直肠癌及正常组织的表达差异进行了分析,结果表明HEPIS在正常直肠组织高表达,进一步采用RISH分析了 HEPIS在40例直肠癌和癌旁组织的表达差异,分析表明HEPIS在正常直肠组织的表达显著高于癌组织(P＜0.01),与GEPIA分析结果一致,说明HEPIS可能是直肠癌的一个潜在抑癌基因.     

澳洲坚果MtMADS1-like基因的克隆与表达分析

MADS～box家族基因广泛分布于植物中,在植物花发育的整个阶段起着至关重要的作用.为了探索MADS-box基因在澳洲坚果花发育过程中的分子机理,本研究以澳洲坚果'695'为试材,采用RT-PCR及RACE技术克隆获得澳洲坚果MADS-box类转录因子基因cDNA全长,命名MtMADS1-like(GenBank登录号:MK491608).该基因全长967 bp,开放阅读框ORF长672 bp,编码223个氨基酸,5'-UTR和3'-UTR分别为58 bp和237 bp.序列分析表明,MtMADS1-like具有保守的MADS-box结构域(MADS-MEF2-like)和半保守的K-box结构域,属于Type Ⅱ型MADS-box家族基因.进化分析表明,MtMADS1-like与其他植物中MADS-box蛋白具有较高的同源性,且与猴面花(Erythranthe guttata)MADS-box家族中SVP254的同源性高达67.10％,亲缘关系最近.生物信息学分析表明MtMADS1-like属于不稳定的亲水性蛋白,不具备信号肽,属于非分泌蛋白,α-螺旋和无规则卷曲构成了二级结构的主要蛋白框架,三级结构中MADS-box结构域和K-box形成该蛋白的核心结构,并且作为转录因子定位于细胞核.qPCR分析表明,MtMADS1-like基因在不同的澳洲坚果品种中差异表达,在品种'333'中表达量最高,在品种'344'中表达量最低.研究结果为进一步验证MtMADS1-like的功能及阐明澳洲坚果花发育和开花调控的分子机制奠定了基础.     

体外转录的自我复制型mRNA疫苗研究进展*

自我复制型mRNA是一种灵活的疫苗平台,该平台的开发基于甲病毒表达载体,其中复制必需基因得以完整保留,而结构蛋白基因则被来自病原的抗原基因替换。由于避免了病原培养、毒力返强和现存免疫的干扰,使其成为疫苗快速设计的理想平台。大量研究数据显示,此类疫苗可应用在人、小鼠、兔、猪、禽甚至鱼类体内诱导体液免疫和细胞免疫。过去,自我复制mRNA疫苗的研究采用重组单载体的模式,基因组骨架来源于辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒。现在,反式复制型RNA和核酸修饰的反式复制型RNA作为下一代技术平台被寄予厚望。对基于甲病毒表达载体的mRNA疫苗技术的研究进展进行概述,重点介绍针对以流感病毒、新型冠状病毒和寨卡病毒等为代表的自我复制型mRNA疫苗研究现状,并探讨了该技术平台的未来发展方向。     

基于CRISPR/Cas生物传感原理的病原菌检测技术研究进展*

病原菌的快速准确检测是实现疫情高效防控、疾病精准治疗、污染环境及时处置的关键。而现有的病原菌现场快速检测技术,主要以定性分析为主,假阳性/假阴性受到诟病,检测准确性仍有待提升,亟待发展基于新原理、新方法的病原菌快速检测技术。基于CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的生物传感技术因具有高灵活性(对不同的基因靶点只需改变crRNA序列)、高特异性(单碱基分辨)、高灵敏(优于10^-18 mol/L浓度)、可编程、可模块化、低成本、可在各种体外介质中高效稳定运行等独特优势,打破了传统分子诊断与检测技术的局限性,正在成为下一代病原菌检测技术的引领者。在该技术中,Cas效应蛋白被用作高特异性的序列识别元件,结合不同的生物传感机制,即可用于病原菌的高特异性快速灵敏检测。在总结CRISPR/Cas生物传感技术原理的基础上,综述了用于病原菌检测的CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13生物传感技术研究进展。通过阐述CRISPR/Cas生物传感技术在实际应用中面临的挑战,展望其未来的发展前景。     

蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10于大肠杆菌不同载体的可溶性表达策略研究

蒙古黄芪病程相关蛋白（Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10, AmPR-10）具有核酸酶活性,对黄芪生长发育及抗病机制具有重要意义。但从天然黄芪中提取蛋白质的传统方法成本较高,蛋白得率较少。研究首次利用大肠杆菌表达体系对AmPR-10进行可溶性外源表达,构建了3种重组子：①以pET28a为载体构建pET28a-AmPR-10;②以pET30a为载体构建pET30a-AmPR-10;③以pET30a为载体、大肠杆菌分子伴侣skp修饰构建pET30a-skp-AmPR-10。通过SDS-PAGE分析,目的蛋白可溶性表达量比较结果是：pET30a-skp-AmPR-10 > pET30a-AmPR-10 > pET28a-AmPR-10。由蛋白质三级结构模拟分析发现,载体pET-30a上的标签S-tag通过影响AmPR-10局部α螺旋构象而提高目标蛋白的可溶性表达,分子伴侣skp通过提高融合蛋白整体α螺旋比例进一步提升目标蛋白可溶性表达量。研究解决了目前从天然黄芪中提取蛋白操作复杂、提取量小的问题。同时,经测定,目的蛋白具有核酸酶活性,为外源AmPR-10相关活性研究提供了依据。     

九香虫保幼激素环氧水解酶基因克隆、生物信息学及表达分析

[目的]保幼激素环氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)是昆虫体内保幼激素(Juvenile hormone,JH)的主要降解酶.本文旨在分析九香虫Aspongopus chinensis Dallas保幼激素环氧水解酶基因序列(AcJHEH)信息,探索其在九香虫生长发育过程中的作用.[方法]以九香虫成虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得AcJHEH基因序列,并利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;采用qRT-PCR技术检测并分析九香虫不同龄期和不同组织中AcJHEH的相对表达量.[结果]成功获得了AcJHEH的完整开放阅读框ORF序列,全长均为1 363 bp,共编码453个氨基酸,预测分子量为51.74 ku,等电点(pI)为7.66,分子蛋白式C2414H3683N581O653S14,含有N-端跨膜基序XWG、催化三联体、保守基序HGWP和2个酪氨酸,属于环氧水解酶家族.系统进化树分析表明,AcJHEH与茶翅蝽Halyomorpha halys的JHEH聚为一支,再与同为半翅目的臭虫Cimex lectulariu和绿盲蝽Apolygus lucorum的JHEH聚为一类.荧光定量PCR结果显示,AcJHEH在九香虫不同发育阶段和各组织中均有表达,且脂肪中的表达量极显著高于其它组织(P＜0.001);滞育九香虫成虫表达量最高,其次为4-5龄若虫都极显著高于其它发育阶段(P＜0.001).[结论]九香虫JHEH属于环氧水解酶家族,确定为保幼激素环氧水解酶.依据qPCR结果推测AcJHEH通过改变九香虫体内保幼激素浓度来影响九香虫4-5龄若虫蜕皮发育、成虫生殖系统发育和滞育等.     

中华蜜蜂AcNPC2b的原核表达和鉴定

[目的]中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂),其胞内胆固醇转运体AcNPC2a能够识别并结合几种微生物的细胞壁,AcNPC2存在于该蜂触角,参与嗅觉通讯,关于AcNPC2b的功能尚未见报道.[方法]通过对中华蜜蜂AcNPC2b基因进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清;利用荧光定量PCR和免疫印迹检测AcNPC2b的转录活性及蛋白水平,通过微生物结合测定对AcNPC2b的功能进行探索.[结果]中蜂AcNPC2b含有信号肽和ML结构域,具有3个二硫键,与果蝇Drosophila melanogaster DmNPC2b聚为一个亚枝.荧光定量qRT-PCR检测发现,感染中蜂囊状幼虫病毒(Chinses sacbrood virus,简称CSBV)的幼虫体内AcNPC2b基因的表达呈现出先微弱下调再持续上调的趋势.获得了约16ku的重组蛋白AcNPC2b并制备了多克隆抗体,免疫印迹结果表明,中蜂AcNPC2b蛋白在工蜂头、胸与中肠中的表达量最高,触角、马氏管与脂肪体中次之.AcNPC2b蛋白在正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫中均有表达,且在感染CSBV的中蜂幼虫中有微弱上调.重组蛋白AcNPC2b微生物结合测定实验结果显示中蜂AcNPC2b重组蛋白均能与活的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌以及白僵菌结合.[结论]正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫体内AcNPC2b基因转录水平和AcNPC2b蛋白的表达含量存在差异,重组蛋白AcNPC2b具有识别并结合病原菌的能力,为后续深入研究AcNPC2b蛋白的分子功能奠定了一定理论基础.