A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较

用ＨｉｔｒａｐＰｒｏｔｅｉｎ－ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析系统,对不同动物血清或抗血清抗体的纯化效率进行了比较,为选择抗体纯化方法提供依据。该方法简便快速,纯化的抗体纯度高,能较好地保持抗体免疫学活性。层析柱反复使用４０多次,纯化抗体效率不变。但Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ对不同动物血清的ＩｇＧ吸附能力不同：对兔和豚鼠的血清抗体吸附能力强     

抗肿瘤血管抗体AA98功能片段VH/κ的脲浓度梯度柱复性

利用稀释法、凝胶过滤、脲浓度梯度凝胶过滤3种方法研究了抗肿瘤血管抗体功能片段VH/κ的体外复性.通过考察复性液中还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例、精氨酸浓度、pH值、洗脱速度、变性液中蛋白质浓度、凝胶过滤脲梯度长度等因素,发展了脲梯度凝胶过滤柱复性VH/κ的方法.结果表明,与传统的稀释法和柱复性法相比,脲梯度法复性获得的VH/κ的活性回收率和相对亲和力均有显著提高.     

人源抗滋养层细胞表面抗原?鄄2基因工程抗体Fab的制备及特性分析

应用噬菌体抗体库技术制备全人源抗滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)特异性Fab抗体片段．抗体库经细胞筛选和固相抗原筛选,获得特异性的阳性克隆．阳性载体经核酸序列分析后,构建工程菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,呈现28 ku和32 ku大小的两条蛋白质条带．Fab分子经流式细胞术、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与BxPc3细胞膜蛋白特异性结合,而与NIH3T3细胞不结合．免疫共沉淀与质谱分析结果表明,该Fab分子能够与Trop-2蛋白特异性结合．免疫组化显示,该抗体可结合胰腺癌细胞膜蛋白,在细胞培养液中加入Fab,能够抑制BxPc3细胞的生长．以上研究结果提示,该抗体有望成为胰腺癌临床影像诊断或治疗的候选分子．     

NPR1多肽抗体的制备和应用

根据NCBI GenBank中报道的NPR1一级结构信息,采用Blastn、Blastx、ExPASy和Protean等软件进行序列同源性和抗原性指数分析,获得三段序列特异性较高的多肽,并从中优选一段序列特异性多肽,采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽,采用HPLC和LC-MS测定合成多肽的浓度和分子量,试验表明目的多肽纯度达88%、目的多肽分子量为1.92234 kD。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH进行偶联获得免疫原Pep-KLH,并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体,采用ELISA和Western blotting测定其效价和特异性,经ELISA检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep发生特异性免疫反应,经Western blotting试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带,其相对分子量为65 kD,与预测分子量相符,表明利用该方法制备的NPR1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。     

HIV—lgag／IFNα—2b表达产物的生物活性研究

目的 :将艾滋病病毒核心蛋白 (gag)与干扰素 (IFNα - 2b)融合基因表达的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠 ,动态观察小鼠的体液免疫、细胞免疫与CTL应答。方法 :将IFNα - 2b基因片段插入到gag基因的nt5 31位点 ,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选 ,挑出重组痘苗病毒。经SDS -PAGE和Westernblot鉴定表达产物。以小鼠为实验对象 ,用重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα - 2b免疫小鼠 ,用ELISA方法检测血清IgG抗体含量。用流式细胞仪测定小鼠外周血CD 4 、CD 8T淋巴细胞计数。 3H -TdR掺入法检测细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性。结果 :血清IgG抗体含量逐渐增高 ,实验组与对照组比较差异有显著性意义 (p <0 .0 5 )。CD 4 、CD 8T淋巴细胞计数、CTL检测实验组与对照组比较差异均有显著性意义 (p <0 .0 5 )。结论 :重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα - 2b能增强小鼠的体液免疫、细胞免疫和CTL应答。IFNα - 2b可以作为免疫佐剂增强机体的免疫状态。     

细胞工程

<正>抗核酸单克隆抗体可以为阐明核酸一蛋白质交互作用提供一种独特的模型。用SpZ/O骨髓瘤细胞与来自MRL/lpr的脾细胞或经过特异免疫的BALB/小鼠的脾细胞相融合,再经过两次克隆而选择出杂交瘤细胞系。已建立一种硝酸纤维滤膜测定法。将已经放射性标记的DNA再经超     

丙型肝炎病毒ns2基因的克隆及其表达

以p90-HCV为模板,通过PCR分别得到全长和截短(2881-3078 bp)ns2基因.将截短ns2基因克隆到pET32a原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了Trx-His-NS2C融合蛋白的可溶性高表达.通过His 树脂纯化得到融合蛋白,免疫家兔获得高效价高特异性的抗体.同时构建了含有全长ns2基因的重组腺病毒,利用该重组病毒感染HepG2和293细胞成功的表达23.2kDa的NS2蛋白.本文的研究为进一步开展NS2蛋白的结构与功能研究奠定了良好的基础.     

载脂蛋白ApoE的原核表达以及与PrP蛋白间相互作用的初步研究

利用RT-PCR方法从人源细胞系SH-SY5Y cDNA中扩增出载脂蛋白ApoE基因,并在pET32a载体中表达融合蛋白His-ApoE,以纯化的融合蛋白免疫实验用兔获得特异性抗体,利用ELISA及免疫共沉淀方法对ApoE及PrP之间的相互作用进行研究.结果表明,SDS-PAGE显示表达的His-ApoE蛋白的相对分子量约为54 000,所制备的抗血清ELISA效价可达到1∶406 900,并能够有效地识别重组及动物组织中的内源性ApoE蛋白.ELISA和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的ApoE可与全长的PrP蛋白（PrP23-231）在体外发生相互作用,其作用位点可能位于PrP蛋白的N端.这些结果为TSE经血传播的机制研究提供了新思路.     

Vi-PHA试剂的研制及其在检测伤寒带菌者中的应用

用纯化伤寒沙门氏菌的Vi抗原,以1 μg／ml量致敏鞣化醛化绵羊红细胞,研制成Vi—PHA试剂,用于伤寒病后慢性带菌者的检出及食品从业人员伤寒健康带菌者的筛选。具有敏感性高、特异性强和稳定性好等特点。本试剂能检出1．16μg／ml Vi-抗体。对健康人群血清无交叉,而与非伤寒病种患者血清仅有0．84％交叉反应。用于检测274例伤寒病后3个月以上和1年以内康复者血清,阳性19例,占6．93％。其中14例粪便培养出伤寒沙门氏菌,占Vi—PHA总阳性率的73．68％o 106例疫区食品从业人员Vi—PHA阳性3例,其中1例培养出伤寒沙门氏菌。255例Vi—PHA≤1：20的伤寒病后康复者,无1例粪检阳性。结果表明,伤寒康复者血清中Vi抗体与其体内带菌具有较高的特异性和相关性。此外,本试剂所采用的方法操作简便,时间快速,结果判断清晰,易在基层推广。     

青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。