山羊生殖细胞特异报告载体pVASA-EGFP的构建及表达

为监测成体干细胞向生殖细胞分化的过程,分析生殖细胞特异性DEAD-box家族ATP依赖RNA解旋酶vasa在不同日龄山羊睾丸组织中的表达情况并构建山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP。通过免疫荧光及RT-PCR法监测vasa的表达情况,利用分子技术构建报告载体p VASA-EGFP,脂质体法转染山羊骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),经过视黄酸(Retinoic acid,RA)诱导后,观察绿色荧光蛋白表达情况以鉴定该报告载体的有效性。免疫荧光结果显示,Vasa在性成熟不同阶段的山羊睾丸组织中均有表达,RT-PCR结果表明vasa基因在3月龄、10月龄山羊睾丸组织中显著高于10日龄组。测序及酶切鉴定结果表明,扩增的vasa基因启动子片段成功连至N1载体,转染BMSCs后经4 d的RA诱导,发现有绿色荧光蛋白表达,表明成功构建了山羊vasa基因启动子调控的报告载体p VASA-EGFP。以上结果表明,vasa基因在不同日龄山羊睾丸组织中均有表达,所构建的山羊生殖细胞特异性报告载体p VASA-EGFP具有示踪山羊成体干细胞向生殖细胞分化过程的能力,为下一步监测山羊BMSCs向生殖细胞分化的过程提供了鉴定和筛选方法。     

正常山羊腰椎间盘营养途径的DCE-MRI观察

目的 研究正常山羊腰椎间盘软骨终板营养途径.方法 选取健康24月龄山羊8只,每只山羊观察4个腰椎间盘,共32个腰椎间盘.麻醉后,行磁共振动态增强扫描,观察感兴趣区的信号变化特点.分别测量增强前及增强后0 min、5 min、10 min、30 rain、1 h、1.5 h、2 h,2.5 h、3 h、3.5 h感兴趣区信号强度值,分析时间-信号强度曲线及峰值出现时间.结果 椎体磁共振信号强度在0 min时达到高峰后迅速下降;软骨终板区在30 min时缓慢达到第一高峰后轻度下降,于2 h上升达到第二高峰;髓核在5 min内为负值,之后缓慢上升于2 h达到高峰,随后逐渐下降.结论 正常山羊腰椎椎间盘主要通过软骨终板途径进行营养代谢.     

tPA/gGH双基因转染山羊乳腺上皮细胞表达分析

人组织纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)是一种被广泛应用于临床的溶栓药物。双基因共整合入生物体内能够产生协同作用,从而提高目的基因的表达水平。但是目前,利用gGH基因与tPA基因共整合以期提高tPA表达水平的相关研究较少。为筛选获得tPA高表达的tPA/gGH双基因整合的单克隆转基因山羊乳腺上皮细胞株,本研究以β-casein基因作为调控序列,构建乳腺特异性表达载体PCL25/gGH,并通过电转染将tPA和gGH双基因共转染山羊乳腺上皮细胞;通过G418筛选获得抗性细胞株,经PCR检测获得转基因单克隆细胞株;利用催乳素诱导tPA表达,收集48 h后细胞诱导液进行ELISA()和Western blotting检测并分析其tPA表达水平。结果表明,共获得142株抗性单克隆细胞,其中有53株tPA单基因整合细胞株,34株tPA/gGH双基因整合细胞株,双基因整合率达23.9%(34/142)。共检测出29株细胞能够表达tPA,其中单基因表达细胞为12株,表达率为22.6%(12/53);双基因表达细胞为17株,表达率为50.0%(17/34);且单基因细胞表达tPA含量为7.5~52.0μg/mL,而双基因细胞表达tPA含量为40~360μg/mL,明显高于单基因表达水平。本研究通过电转染的方式成功获得了tPA/gGH双基因整合的单克隆山羊乳腺上皮细胞株,并证明双基因整合的细胞株表达tPA水平明显提高,为后期制备高表达转基因山羊奠定了基础。     

提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻方法

目的筛选一种既提高精子转染外源DNA效率,又保持解冻后精子活力的山羊精液冷冻—解冻方法。方法应用正交设计L9(34),因素分别为稀释液种类、稀释比例、降温时间和解冻液,每个因素选择3个水平,检测和比较解冻后精子转染外源DNA效率和精子活力。结果所选冷冻—解冻各因素对精液转染效率影响不显著[F(8,18)=1.032,P=0.449];平衡时间对冷冻—解冻活力影响极显著[F(2,24)=9.972,P=0.001],平衡1h极显著小于平衡2 h和4 h的精液活力(P=0.003,P=0.000),以平衡4 h最好。用筛选的冷冻—解冻方法处理精液,解冻后精子的活力极明显降低(P=0.002);生存指数降低,GOT释放量增加,菌落数减少,与鲜精相比差异显著(P=0.018;P=0.016;P=0.018);精子畸形率增加,顶体完整率降低,与鲜精相比差异不显著(P=0.494;P=0.084)。结论优化了提高精子转染外源DNA效率的山羊精液冷冻—解冻方法。     

TALENs介导MSTN基因突变山羊的制备及性能分析

肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是一种骨骼肌生长发育的负调控因子,可以抑制成肌细胞的增殖,是动物品种改良的重要候选基因,该基因突变能够引起骨骼肌的广泛性增生与肥大,产生“双肌”症状,导致动物脂肪分化减少、肌肉含量增加,从而满足市场动物肉品质消费的需求。为了获得“双肌”表型的MSTN基因突变克隆山羊,本研究在山羊MSTN基因第一外显子序列设计并构建TALENs表达载体,转染山羊胎儿成纤维细胞,经嘌呤霉素筛选获得抗性细胞株,通过PCR检测和基因测序筛选MSTN基因突变细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植,并鉴定MSTN基因突变类型;通过组织切片分析MSTN基因突变山羊肌肉组织形态结构,监测不同月龄克隆山羊体重并分析其不同生长发育阶段的体重增长趋势。结果表明,共获得109株MSTN基因突变细胞株,突变效率达到79.0%(109/138),其中46株为双等位基因突变,占细胞株总数的33.3%(46/138)。选取4株生长状态较好的MSTN基因突变细胞株(1株为双等位基因纯合突变,3株为非纯合突变)进行体细胞核移植至12只受体山羊,30d时B超检查出受孕母羊4只,受孕率为33....     

山羊重组促卵泡素长效类似物基因在毕赤酵母中表达

为了获得长效FSH制剂, 利用重叠PCR技术将山羊FSH的a, b亚单位, 通过hCGb亚单位羧基末端延长肽(CTP)基因序列的连接, 构建成单链长效类似物基因FSHb-CTP-a。将其克隆至表达载体pPIC9K, 重组载体线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115中, 经判型和G418筛选后获得高拷贝菌株His+Mut+。经甲醇诱导表达后, 进行SDS-PAGE和Western blot分析表明: 重组FSHb-CTP-a的转化子可以正确有效地表达目的蛋白, 分子量约为29 kD。放射免疫分析法(RIA)测定表达上清, 高拷贝转化子的平均表达量为91.849 mIU/mL, 显著高于低拷贝转化子的平均37.419 mIU/mL的表达量, 为FSH的结构研究和长效FSH制剂的生产奠定了基础。     

山羊M II期卵母细胞胞质支持异种间克隆胚的着床前发育

研究去核山羊(Capra hircus)体内成熟的M II期卵母细胞与异种成年的哺乳动物(包括山羊、波尔山羊、牛、塔尔羊、熊猫)及人的成纤维细胞融合形成的体细胞核移植胚胎着床前的发育能力。结果显示这些异种体细胞核移植重构胚可以完成着床前发育, 并形成囊胚。种内体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为78.67%(557/708)和56.29%(264/469); 亚种间或种间体细胞核移植胚的融合率和囊胚发育率分别为: 波尔山羊78.18%(541/692)、33.90%(40/118), 牛70.53%(146/207)、22.52%(25/111), 塔尔羊53.51%(61/114)、5.26%(3/570), 熊猫79.82%(1159/1452)、8.35%(75/898), 人68.76%(317/461)、5.41%(16/296)。由此结果得出以下结论: (1)山羊M II期卵母细胞胞质与供核细胞之间的亲缘性不影响两者的融合率; (2)山羊M II期卵母细胞的胞质能支持异种间体细胞核移植胚的着床前发育; (3)亲缘关系近的种间核移植胚的囊胚发育率高于亲缘关系远的种间核移植胚的。     

冷冻对山羊精子转染外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响

本实验将鲜精和冻精分别与地高锌标记的线形化的pEGFP-N,质粒孵育转染,用原位杂交方法检测转染效率;PCR和Southern Blotting检测精子与外源DNA的整合效率;与成熟卵母细胞体外受精,PCR检测阳性胚胎比率,用透射电镜技术、碘化丙锭和羟化荧光素双探针技术和单细胞电泳（Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE）技术,观察精子冷冻前后的超微结构、精子质膜完整性和精子核DNA损伤的变化,研究冷冻对山羊（Caprahircus）精子转染内化外源DNA和体外制备转基因胚胎的影响及机理。结果表明,冻精显著提高了转染外源DNA的效率（81．60％±16．59％VS32．95％±2．93％,t=4．873,P=0．003;41．80％±6．26％vs27．89％±8．64％,t=2．634,P=0．039）。PCR和Southern Blotting检测表明外源DNA已经整合到精子基因组上。用冻精与成熟卵母细胞体外受精,体外受精穿透率和卵裂率显著低于鲜精组（24．19％±3．15％vs58．86％±3．73％,t=7．131,P〈0．001;11．83％±2．37％vs29．71±3．47％,t=4．302,P〈0．001）,但体外生产的胚胎PCR阳性率比鲜精组显著提高（45．45％±10．87％VS24．44％±6．06％,t=1．750,P=0．013）。超微结构观察和双荧光探针检测都发现冷冻-解冻精子质膜完整性降低（8．34％±4．21％VS65．67％±6．46％,t=12．492,P〈0．001）,SCGE显示冷冻极显著增加了精子彗尾长度和彗星细胞比例（42．67μm±4．56μmvs21．14／Lm±2．36μm,t=5．644,P=0．005;60．00％±4．00％vs17．37％±2．57％;t=15．787,P〈0．001）。冷冻-解冻可以提高山羊精子转染外源DNA的效率,冷冻破坏精子质膜完整性,解除质膜的阻碍作用,是提高外源DNA转染效率的一个主要原因[动物学报54（6）：1089-1097,2008]。     

山羊、绵羊MT-Ⅳ分子特性研究

金属硫蛋白(MTs)是一类低分子量、金属和半胱氨酸含量高的细胞质蛋白, 哺乳动物的MTs包括MT-I、MT-II、MT-Ⅲ和MT-IV 4种亚型, 其中MT-IV只在磷状复层扁平上皮细胞中表达, 相关研究报道较少。本研究根据GenBank已公布的动物MT-IV基因序列, 设计出扩增山羊和绵羊MT-IV基因的特异性PCR引物MT-IVSP1和MT-IVSP2, 利用RT-PCR的方法, 分别从山羊和绵羊的瘤胃组织mRNA中, 克隆出山羊和绵羊的MT-IV基因编码区序列(均为189 bp), 序列登录GenBank, 获得序列号EF470251和EF624067。通过序列分析, 表明山羊和绵羊两个物种MT-IV基因编码区全编码均为189 bp、编码62个氨基酸, 其中绵羊的MT-IV含有20个半胱氨酸, 而山羊第61位保守的半胱氨酸被色氨酸所代替。两个物种的MT-IV均不含芳香族氨基酸, 含有MTs特有的C-X-C、C-X-X-C、C-C-X-C-C结构, 无明显的跨膜结构域, 无信号肽, 是一种细胞质蛋白。二级结构分析表明两个物种的MT-IV二级结构大多数为无规则卷曲结构, 分别在第7~9和第49~51氨基酸残基性存在折叠结构, 不存在螺旋结构。三级结构预测结果表明两个物种MT-IV的三级结构由a和b两个结构域组成, 其中β结构域相同, a结构域山羊少一个半胱氨酸残基, 其结构与绵间存在明显差异, 这一差异可能对山羊MT-IV的生理功能产生一定影响, 有必要深入研究。     

中卫山羊核心产地植物群落的数量分类与排序

应用数量分类(TWINSPAN)和DCA排序方法,对我国特有裘皮用山羊(中卫山羊)核心产地——宁夏香山地区植物群落进行多元分析,根据TWINSPAN分类结果,并结合生态特征将所调查的28个样地植被分为6组,代表了该山地在海拔、地形、土壤、山坡坡度等环境作用下植被空间的分布格局。TWINSPAN分类结果与DCA排序结果较一致,DCA排序第一轴结果主要体现出海拔和山坡坡度对植被分布的作用,第二轴结果主要体现了地形(坡向)和土壤基质(沙地、石质山坡、土质山坡)对植被分布的作用。影响该干旱山地植被分布的主要环境因子有海拔和山坡的坡度,另外长期过度放牧对植被的空间分布影响较大,导致了该山地系统植被空间结构紊乱,并干扰了群落数量分析结果的准确性。