山羊重组促卵泡素长效类似物基因在毕赤酵母中表达

为了获得长效FSH制剂, 利用重叠PCR技术将山羊FSH的a, b亚单位, 通过hCGb亚单位羧基末端延长肽(CTP)基因序列的连接, 构建成单链长效类似物基因FSHb-CTP-a。将其克隆至表达载体pPIC9K, 重组载体线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115中, 经判型和G418筛选后获得高拷贝菌株His+Mut+。经甲醇诱导表达后, 进行SDS-PAGE和Western blot分析表明: 重组FSHb-CTP-a的转化子可以正确有效地表达目的蛋白, 分子量约为29 kD。放射免疫分析法(RIA)测定表达上清, 高拷贝转化子的平均表达量为91.849 mIU/mL, 显著高于低拷贝转化子的平均37.419 mIU/mL的表达量, 为FSH的结构研究和长效FSH制剂的生产奠定了基础。     

山羊品种间体细胞核移植研究

萨能奶山羊是著名的奶用山羊品种,波尔山羊则是世界著名的肉用山羊品种.为了研究波尔山羊体细胞在奶山羊卵母细胞中的去分化,我们将成年波尔山羊的颗粒细胞或耳皮肤成纤维细胞作为供核细胞(试验组),移入奶山羊中Ⅱ期的去核卵母细胞透明带下,经电融合和离子霉素与6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活,直接移入同期发情奶山羊输卵管或经体内培养,将发育的重构胚移人同期发情羊子宫内.妊娠早期作B超诊断,确立妊娠的观察至足月.同时将奶山羊的35日龄胎儿成纤维细胞作供核细胞(对照组),按试验组同样方法处理,将重构胚直接移入同期发情的奶山羊输卵管内.结果试验组,波尔羊颗粒粒细胞与耳皮肤成纤维细胞的融合率分别为78.2%(115/147)、57.4%(116/202),重构胚卵裂率为85.8%(115/134),桑椹胚、囊胚的发育率38.8%(52/134),早期妊娠三头,分别于妊娠40、60、60日龄终止妊娠.对照组,融合率为89.5%(136/152),早期妊娠率为42.9%(6/14),四头受体足月分娩,产四头公羊羔,其中三头存活,一头分娩时死于肺不扩张,并体重过大,显示胎儿过大综合症.经基因型鉴定证实,这四头克隆羔羊均源于同一胎儿成纤维细胞系.以上结果表明,波尔羊体细胞核在奶山羊卵母细胞中能够去分化,并维持一定程度的发育.     

山羊MyoD基因家族多态性及与体尺性状的相关性

用PCR-SSCP技术研究了波尔山羊和徐淮山羊2个群体共147个个体MyoD基因家族中3个基因座位的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。结果表明, 在徐淮白山羊群体中, myf-5基因座发现有3种基因型AA、AB和BB, 波尔山羊均为AA型。在myf-6基因座和myoD 5′侧翼区基因座, 两个山羊群体均检测到了AA和AB型个体。对山羊myf-5、myf-6基因座, myoD 5′侧翼区基因座不同基因型与两品种山羊体尺性状相关分析表明, myf-5基因座对管围和管围指数的效应差异显著(P<0.05)。myf-6基因座对徐淮白山羊体尺性状的效应均不显著(P>0.05), 而对波尔山羊的体高和管围指数效应差异显著(P<0.05)。两个山羊品种myoD 5′侧翼区不同基因型个体的体尺性状差异均不显著。     

牛-牛及山羊-牛克隆胚胎体外培养条件的优化

通过胞质内注射法将牛和山羊胎儿耳朵成纤维细胞分别注入去核牛卵母细胞中构建同种胚胎和异种胚胎。采用mCR2aa和mSOF分别培养,然后在mSOF中按不同培养时间添加8mg/mLBSA或者10?S,培养前3d和培养3d后添加的补充物质及次序为:(1)BSA FBS;(2)BSA BSA;(3)FBS BSA;(4)FBS FBS。根据培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率及囊胚细胞数筛选出最好的培养方法。结果:(1)mSOF中培养同种胚胎和异种胚胎的卵裂率,8/16-cell发育率以及囊胚发育率均明显高于在mCR2aa中的培养结果(P<0.05)。(2)添加BSA FBS组的mSOF培养胚胎的卵裂率、8/16-cell发育率、囊胚发育率和囊胚细胞数同种依次为79.8%±7.1%、49.7%±3.5%、21.5%±1.8%和115.2±4.3,异种依次为40.1%±6.3%、29.2%±2.0%、13.4%±2.1%和100.1±3.0,均明显高于其他培养组(P<0.05)。结论:山羊-牛异种克隆胚胎可以用优化的牛胚胎培养体系进行培养。同种胚胎和异种胚胎的最佳培养方法均为前3d用mSOF BSA培养液,3d后用mSOF FBS培养液。     

重组腺病毒介导的人尿激酶原突变体在山羊乳汁中的表达

构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1~4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1~4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。     

藏山羊KLF8基因克隆及组织表达分析

本试验旨在获得藏山羊KLF8基因序列,并分析其生物学特征,同时阐明该基因在不同组织中的表达情况。利用RT-PCR技术克隆藏山羊KLF8基因序列,利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)检测其在藏山羊各个组织中的表达丰度。结果表明,获得藏山羊KLF8基因序列1 069 bp,其中包含CDS区1 008 bp,5'UTR序列28 bp和3'UTR序列33 bp,共编码335个氨基酸,为不稳定亲水碱性蛋白。KLF8基因在藏山羊的肺脏组织中表达水平最高,极显著高于其他组织(p<0.01)。本研究为进一步阐明KLF8基因在藏山羊中的生物学功能提供了依据。     

山羊β—乳球蛋白基因5‘侧区的克隆,测序和序列分析

采用ＰＣＲ方法,首次从中国山羊肝组织扩增出β－乳球蛋白基因的５＇侧区８６７ｂｐ片段,其中包括７７０ｂｐ的启动子和９７ｂｐ的部分第一外显子,再克隆测序。然后,我们用计算机分析比较了山羊βＬＧ基因的５＇侧区与绵羊的和乳牛的同源性,分别为９４．６％和８８％。还发现上述三该区域中的转录因子结合位点及其序列都很相似。而已知绵羊与乳牛的βＬＧ基因启动子可指导外源基因在转基因动物中组织选场划性地高效表达,这提     

山羊早期胚胎发育的超微结构研究

本实验以促卵泡刺激素(FSH)进行超排处理所得的胚胎为材料,首次对山羊附植前胚胎发育过程中的超微结构变化进行了系统的研究。结果表明:(1)在桑椹期以前,胚胎中大都为带帽线粒体,从此期开始这种线粒体明显减少;从四细胞期开始,出现基质浅具横嵴的线粒体,且以后各期逐步增多。具横嵴的线粒体可能由带帽线粒体的帽状泡消失后转变而来。(2)核仁从四细胞期开始网状化,以后网状化程度逐步增强,颗粒部明显增加。(3)间隙连结最早形成于4细胞期,紧密连结和桥粒分别从8细胞期开始出现。