减压病山羊纤维蛋白原肽链结构与空间构象的研究

本文报道了减压病山羊纤维蛋白原(FG)结构变化及减压病(DCS)气-血界面活性引起凝血反应的作用。雄性山羊15只,加压-减压发生Ⅰ或Ⅱ型DCS,采静脉血用冷乙醇提取血浆FG。经SDS-PG电泳和CM_(22)-色谱分离S-磺酸化FG,发现FG裂解肽段——带4和X、Y峰,(正常对照组无);经HPLC和组分分析发现FG含量和FG氨基酸残基数明显减少(P<0.05),表明FG参入凝血反应其肽链发生裂解。又经圆二色谱分析发现FG α-hilex％明显下降(P<0.01)。DCS山羊FG结构的改变,证实了气-血界面活性作用引起凝血反应。     

山羊不同组织器官的内参基因筛选

本研究通过比较9个内参基因在山羊不同组织中的表达水平进而确定最适合研究山羊组织表达的内参基因。本试验以简州大耳羊为试验材料,利用实时荧光定量PCR技术分析9个内参基因(GAPDH,PPIA,18S rRNA,PPIB,UXT,RPLP0,ACTB,EIF3K和TBP)在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、瘤胃、背最长肌和皮下脂肪等组织中的表达差异情况,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等程序分析了它们的表达稳定性。geNorm和NormFinder程序一致显示TBP表达最稳定,其次是UXT和RPLP0;BestKeeper分析显示18S rRNA表达最为稳定,其次为TBP和ACTB;3个程序一致认为GAPDH表达稳定性最差。综合3个程序分析得出TBP最适合作为山羊组织中的内参基因,其次为UXT和RPLP0,GAPDH表达稳定性最差,不适合作为山羊组织内参,这为后续研究其他目的基因在山羊组织器官中的表达模式提供数据保障。     

人工锌指核酸酶突变EGFP基因的功能分析

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因 (EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因 (EGFP) 细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。     

关节镜制备膝关节软骨缺损的动物模型

目的:经微创手术制备膝关节软骨缺损动物模型,减少因手术创伤造成对实验结果的影响。方法:关节镜下对9只山羊(9膝)进行关节面钻孔术,造成软骨缺损模型,对其缺损位置进行准确定位。结果:9只山羊(9膝)均在关节镜下顺利进行了关节软骨缺损模型的建立,并进行了缺损部位的定位。结论:对比开放性手术,经关节镜制备关节缺损模型是一种对实验干预最少的微创方法,有助于减少手术本身造成的实验误差。     

miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用

旨在明确miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用,探讨其发挥调控作用的可能机制。利用化学合成的miR-301b mimics和miR-301b siRNA,通过脂质体转染法在山羊肌内脂肪细胞过表达和干扰miR-301b,并通过油红O染色、qPCR和生物信息学分析等方法,从细胞形态学和mRNA水平明确miR-301b对山羊肌内脂肪细胞分化的调控作用,并初步探究其可能的作用机制。结果表明,过表达miR-301b效率约29 290倍,细胞形态学结果显示,过表达miR-301b后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少,甘油三酯合成降低。qPCR结果显示,过表达miR-301b后成脂标志基因CEBPα、PPARγ、SREBP1、LPL表达水平极显著下调(P<0.01)。miR-301b干扰效率约60%,干扰miR-301b表达后,细胞形态学结果显示,山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚增加,甘油三酯合成升高。qPCR结果显示,干扰miR-301b后成脂标志基因AP2、CEBPα、CEBPβ、PPARγ、SREBP1、LPL表达水平极显著上调(P<0.01)。通过对miR-301b生物信息学分析,推...     

贵州四个山羊品种mtDNA多态性及起源分化

采用１５种限制性内切酶,研究贵州省４个山羊品种共９３只个体的线粒体ＤＮＡ多态性。其中ＢｏｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ３种酶的酶切类型存在多态。共检测到１８种限制性态型,归结为３种ｍｔＤＮＡ单倍型。单倍型Ⅰ、Ⅱ在贵州山羊４个品种分布频率较高,分别为７７．４２％和２１．５０％,单倍型Ⅲ分布频率较低（１．０８％）;品种间亲缘关系聚类分析表明白山羊和黑山羊亲缘关系最近,其次为黔林羊,而与小香羊的亲缘关系最     

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化北大核心CSCD

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。