骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。     

NRS2002评分和血清白蛋白值与门诊肺结核患者病情的相关性

目的评价NRS2002评分和血清白蛋白(ALB)值与门诊肺结核患者病情的相关性。方法选择2017年10月至2018年9月在余姚市人民医院肺结核门诊就诊的290名肺结核患者为研究对象。患者首次就诊时进行NRS2002营养筛查,NRS2002评分≥3分判定为存在营养风险。检测患者血清白蛋白(ALB)值,ALB≤35 g/L判定为营养不足。观察患者NRS2002评分、ALB值与肺结核患者痰液结核分枝杆菌阳性、肺结核空洞等情况的相关性。结果 NRS2002评分、年龄与肺结核患者的病情相关。NRS2002评分≥3分以及ALB≤35 g/L的患者痰液结核分枝杆菌阳性率和存在肺结核空洞的比例均高于NRS2002评分3分和ALB35 g/L的患者(均P0.05)。多因素回归分析显示,NRS2002评分≥3分、年龄40岁为肺结核患者痰液结核分枝杆菌阳性的危险因素;而年龄、性别、NRS2002评分和ALB值均不是患者肺结核空洞的危险因素。结论 NRS2002评分≥3分、ALB≤35 g/L的肺结核患者更容易出现痰液结核分枝杆菌阳性情况。肺结核患者营养状况与肺结核患者病情具有一定相关性。     

大鼠慢性进行性肾病的病理学特点

目的为大鼠慢性进行性肾病(chronic progressive nephropathy,CPN)的发病和相关的病理学研究积累资料。方法进口SD大鼠60只、国产SD大鼠120只、国产Wistar大鼠240只,分别给予进口饲料和国产饲料,持续饲养104周后剖杀,采集大鼠肾并进行常规制片,HE和特殊染色后,显微镜观察组织形态改变,总结和比较不同品系、不同性别、不同饲料喂养的大鼠CPN的发生率和病变特点。结果肾小球毛细血管基底膜和系膜增生及节段硬化为CPN发病的先发病变,肾小管上皮的变性和再生以及间肾质纤维化是继发性改变;CPN的总发病率为31.87%,其中雄性大鼠的发生率为48.54%,雌性大鼠的发生率为15.12%;Wistar大鼠CPN的发生率高于SD大鼠;进口SD大鼠CPN发病率高于国产SD大鼠;用蛋白含量高的饲料喂养大鼠CPN的发生率高于蛋白含量低的饲料喂养的大鼠。结论肾小球病变在先,导致肾小管出现继发性改变。CPN有较高的发病率,性别和品系之间有差异,饲料蛋白含量不同CPN发生率有差异。     

利用CRISPR-Cas9敲除Tyr基因制作白化C57BL/6N小鼠

目的 为了获得白化的C57BL/6N小鼠,扩大其在皮肤移植和胚胎干细胞方面研究中的应用。方法 通过体外设计合成Cas9 mRNA和系列sgRNA(single guide RNAs),注射到小鼠的受精卵内,破坏合成C57BL/6N小鼠黑色素生成必须的酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因序列的第1和第2外显子,产生基因突变,获得F0代白化的C57BL/6N小鼠,然后经过重复回交和自交,形成白化C57BL/6N小鼠近交系。结果 经过注射两对sgRNA,成功的获得了F0代的白化小鼠,在Tyr基因的第1和第2外显子中均发生了缺失突变,小鼠可以将突变基因传递给后代,并在其后代中产生了纯合的白色C57BL/6N小鼠,最后对白化小鼠突变类型进行了分析。结论 通过CRISPR-Cas9技术破坏了小鼠Tyr基因,成功地建立了白化C57BL/6N小鼠近交系,为将来的嵌合体制作、组织移植提供了新的研究工具。     

Fancm基因敲除小鼠构建及其表型分析

目的构建范可尼贫血通路Fancm基因敲除小鼠,研究Fancm基因缺失对小鼠生理功能,特别是雄性生殖器官的影响。方法采用CRISPR/Cas9技术,获得Fancm基因敲除小鼠。分析FANCM蛋白在野生型和Fancm^-/-小鼠睾丸组织中的表达。统计Fancm^-/-小鼠的出生率、体重、性别比例及子代生育情况,分析血液常规指标。组织形态学研究雄性Fancm^-/-小鼠睾丸生理病理表型。结果敲除Fancm基因ATG区域,获得稳定遗传的C57BL/6背景Fancm^-/-小鼠。Fancm^-/-小鼠睾丸中FANCM蛋白表达完全丢失。Fancm^-/-小鼠无明显的胚胎致死现象,但雌性Fancm-/-小鼠数目显著少于雄性Fancm^-/-小鼠。同窝Fancm^-/-小鼠比较野生型体重无明显区别,部分血常规指标有显著性差异。Fancm^-/-小鼠有明显的生殖能力缺陷。雄性Fancm^-/-小鼠睾丸有显著的发育缺陷,其生精细胞凋亡增加、细胞周期阻滞,影响睾丸发育与精子的生成。结论成功获得稳定遗传C57BL/6背景Fancm^-/-小鼠,Fancm基因参与小鼠的生长发育,特别是雄性生殖器官功能的维持及调控。     

古林箐秋海棠叶斑结构对叶色的影响

该研究以古林箐秋海棠(Begonia gulinqingensis)为材料,通过分析叶片形态特征、上表皮光学特性、组织结构、叶绿素含量及叶绿素荧光参数(F_v/F_m),探讨了叶片色斑的形成原因。结果表明:(1)古林箐秋海棠叶斑发生频率和数量无明显规律,但发生部位相对稳定,叶斑主要发生在正对叶柄的两条主脉之间。(2)斑区有两种光反射模式,点状反射和多角形反射,栅栏组织细胞呈近等轴的圆形,排列疏松,与上表皮细胞间存在空隙;非斑区只有点状反射模式,栅栏组织细胞为漏斗型,排列紧密,与上表皮细胞间不存在空隙。(3)斑区和非斑区叶绿体均有密集的堆积基粒和丰富的类囊体膜,斑区叶绿素a、b及总叶绿素含量仅比非斑区分别低24.9%、25.2%、25.1%。(4)叶绿素荧光参数(F_v/F_m)值斑区为0.793,非斑区为0.790。虽然斑区叶绿素含量比非斑区略低,但叶绿体结构完整,且叶绿素荧光参数与非斑区无显著差异。斑区上表皮与栅栏组织细胞间的空隙可使光线到达绿色组织时发生二次反射,在叶片表皮细胞边缘形成白色多边形光反射使该区域相对周围正常叶片区域偏白,基于上述结果可推测古林箐秋海棠的淡绿色块斑形成与特殊的叶片结构有关。     

Fus在斑马鱼生长发育及两性生长异形中的功能

为研究肉瘤融合基因(fus)在鱼类中的功能, 在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9基因突变技术使fus基因产生移码突变。fus-/-纯合突变体斑马鱼发育正常并且完全可育, 但体长和体重在幼鱼和成年阶段都小于野生型斑马鱼。此外, 相较于野生型斑马鱼, fus-/-纯合突变体斑马鱼不存在雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象。在fus-/-纯合突变体斑马鱼早期幼鱼发育阶段, 一些生长相关基因包括gh1、ghra、igf1、igf2a、stat5.1和socs6的表达水平显著低于野生型斑马鱼但其运动能力并未受到影响。因此, 不同于fus基因在哺乳动物中的功能, 它在斑马鱼中不参与运动神经元的发育, 但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着重要的功能。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

间质表皮转化因子通过PI3K/AKT/MMPs信号通路促进肺腺癌细胞的侵袭转移

间质表皮转化因子（mesenchymal to epithelial transition factor,MET）在多种癌症中异常表达,影响肿瘤的发生发展,但MET影响肺腺癌的分子机制并不明确。本研究收集3例淋巴结转移的肺腺癌组织（lung adenocarcinoma tissues,LAD）和3例无淋巴结转移的肺腺癌组织,用于微阵列基因芯片分析。结果显示,与无淋巴结转移的肺腺癌组织相比,有淋巴结转移的肺腺癌组织中有1 314条mRNAs表达上调,400条mRNAs表达下调。其中,MET在有淋巴结转移的肺腺癌组织中表达显著升高。随机选取8个差异表达基因,对收集的潍坊医学院附属医院2014年2月至2017年2月间有淋巴结转移的肺腺癌组织和无淋巴结转移的肺腺癌组织各30例通过qRT -PCR实验进行微阵列基因芯片验证。结果显示,所选mRNAs的表达与微阵列结果一致,验证了微阵列基因芯片结果的准确性。通过Western 印迹进一步检测MET的表达。结果显示,相较于正常肺上皮细胞,肺腺癌细胞中MET的表达显著升高。利用质粒转染,敲减肺腺癌细胞A549中的MET,Transwell侵袭实验结果显示,敲减MET后肺腺癌细胞的侵袭能力明显降低;对各细胞组进行EGF（epidermal growth factor）处理并检测PI3K/AKT/MMPs信号通路,Western 印迹检测结果显示,敲减MET后,肺腺癌细胞中基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2,MMP-2）和MMP-9的表达显著下降, AKT的磷酸化水平也显著下降。上述结果表明,MET可通过激活PI3K/AKT信号通路进而增加MMPs的表达促进肺腺癌的侵袭转移。     

EGCG通过PI3-K/Akt信号通路诱导人甲状腺乳头状癌细胞K1增殖和凋亡的影响

研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)通过PI3-K/Akt信号通路对人甲状腺乳头状癌细胞K1增殖和凋亡的影响。利用MTT法研究不同剂量EGCG对K1细胞的增殖作用;采用流式细胞术分析EGCG对K1细胞周期和凋亡影响;Westernblot方法检测分析EGCG对人甲状腺乳头状癌K1细胞PI3-K、Akt/p-Akt、mTOR、cyclin D1、CDK4、Bcl-2/Bad、cleaved-caspase-3蛋白表达影响。MTT结果显示EGCG作用后K1细胞增殖显著受到抑制,且表现出明显的剂量依赖性和时间依赖性(P0.001);流式细胞术结果显示EGCG能够将K1细胞阻滞于G1期,并且产生剂量依赖性诱导K1细胞凋亡(P0.001);Westernblot结果显示EGCG能够上调K1细胞促凋亡蛋白Bad及cleaved-caspase-3的表达,下调PI3-K、mTOR、cyclin D1、CDK4蛋白表达,降低AKT蛋白磷酸化及抑凋亡蛋白Bcl-2表达(P0.05)。结果证明,EGCG能够通过PI3-K/Akt信号通路,诱导G1阻滞及细胞凋亡,抑制人甲状腺乳头状癌细胞K1增殖。