基于CRISPR/Cas系统的核酸生物传感器

近年来,CRISPR/Cas系统已经成为转录调控和基因组编辑的重要工具。除了在基因编辑领域的贡献,CRISPR/Cas系统独特的靶核酸顺式切割和非特异性单链核酸反式切割能力,在开发核酸检测的新型生物传感器方面展现出巨大潜力。构建基于CRISPR/Cas系统高灵敏度生物传感器的关键通常依赖其与不同信号扩增策略,诸如核酸扩增技术或特定信号转导方法的结合。基于此,本文旨在通过介绍不同类型的CRISPR/Cas系统,全面概述基于该系统的核酸检测生物传感器的研究进展,并重点对结合核酸扩增技术（PCR、LAMP、RCA、RPA和EXPAR）、灵敏的信号转导方法（电化学和表面增强拉曼光谱）和特殊结构设计生物传感的三大类型信号放大策略的CRISPR/Cas生物传感器进行总结和评论。最后,本文对目前的挑战以及未来的前景进行展望。     

多等位基因PCR-SSO反相杂交法及其在HLA-DR_4亚型结构分析中的应用

本文介绍一种适合于多等位基因定型和结构分析的反相顺序特异性寡核苷酸探针杂交方法。将化学合成的多种探针分别经脱氧核苷末端转移酶(TdT)催化,于3′端加上100个以上碱基的Poly(dT)尾,然后将各探针分别以斑点固定于同一张尼龙膜上。用PCR法对该基因位点进行扩增,扩增的同时加入α-~(32)P-dCTP以直接参入放射标记,然后将PCR产物与膜固定探针杂交,以四甲基氯化铵根据探针长度统一洗涤温度。该方法克服了以往对同一份样品进行多个等位基因检测时需要进行多次探针标记和杂交的缺点。我们用该方法对中国人群MHC-Ⅱ类DR4多等位基因进行了研究。     

用PAPO法对流行性乙型脑炎急性期患者外周血白细胞中的乙脑病毒相关抗原定位检测

1991年7－8月在流行性乙型脑炎收治中,用PAP法对急性期患者外周血白细胞进行乙脑病毒相关抗在的检测。结果：总检出率为41．2％（24／51）,各型检出率：轻型25．0％（2／8）、型44．8％913／29）、重型42．9％（6／14）,三型间检出率无差异（P＜0．05）。检出病程最早3天,最迟10天。三种白细胞检出率依次为：中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞,可在三种或二种细胞中同时检出,亦有仅见于一种细胞之中。并就检出意义进行了讨论。     

基于CRISPR/Cas13a的金黄色葡萄球菌mecA耐药基因检测方法的建立

【目的】 针对目前耐药基因检测通常需要依赖专业检测设施和设备,仍缺乏耐药基因快速检测方法这一问题,旨在建立一种基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) mecA耐药基因快速检测方法。【方法】 首先在mecA基因序列的保守区中设计筛选出灵敏度较高的重组酶介导链替换核酸扩增(recombinase aided amplification, RAA)引物和CRISPR RNA (CRISPR RNA, crRNA),通过结合消线法核酸检测试纸技术(easy-readout and sensitive enhanced, ERASE)建立针对mecA基因的检测方法,最后利用模拟样本及临床分离样本对建立的新方法与传统方法进行比较。【结果】 成功筛选出了1组针对mecA耐药基因的高效扩增引物和crRNA,并建立了基于CRISPR-ERASE的mecA耐药基因高灵敏核酸检测方法,最低检出限为10 copies/μL,在32株临床分离的金黄色葡萄球菌中,该方法共检出24株mecA耐药基因阳性菌株,与药敏试验及荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)检测结果符合率为100%。【结论】 建立了一种基于CRISPR-ERASE核酸检测试纸技术的简单、高灵敏的mecA耐药基因检测方法。     

Structural analysis of DMD gene and its clinical application in Chinese.I.Bgl Ⅱ exon—containing fragment,RFLP and carrier detection

This article is one of the serial studies on the characteristics of the molecular structure for dystrophin gene in Chinese.By using the entire dystrophin cDNA(14kb) as a probe,the number and RFLPs of Bgl Ⅱ exon-containing fragments of the dystrophin gene were analysed.Four new Bgl Ⅱ fragments were found,two of them(3.7 and 6.2 kb) detected by comparing the hybridization patterns with cDNA1-2a,1a and 2a,one(9.3 kb) from the hybridization pattern with cDNA 9 by lengthening migrating distance of DNA fragments in electrophoresis,and another and (4.0 kb) by comparing the patterns with cDNA 11-14, 11a,11b,aac-12a and 14.The results indicated that the number of Bgl Ⅱ exon-containing fragments should be 59 rather than 55 reported previously,which laid the foundation of the Bgl Ⅱ partial restriction map for dystrophin gene.Three of the four RFLPs found in Caucacian appear in the hybridization patterns of three subclones,i.e. cDNA 2b-3,cDNA 4-5,and cDNA 5b-7.The values of expected heterozygote frequency(EHF) were 0.33,0.33 and 0.40,and the observed heterozygote frequency(OHF) were 0.40,0.40 and 0.48 respectively.Meanwhile,two new rare allelic fragments(15kb) were found in RFLPs from Bgl Ⅱ/2b-3 and Bgl Ⅱ/4-5a patterns respectively.These Bgl Ⅱ RFLPs and four XbaI RFLPs documented in our laboratory have been used to detect the carrier in 7 DMD families and 1 BMD family.Of the 69 individuals from the 8 families,11 females were diagnosed as the carriers with DMD mutation,4 females as the doubtful carriers,12 females were defined as normal genotype and 2 females as probably normal.The results suggest that the carrier testing method based on dosage intensity analysis and genotype analysis by using dystrophin cDNA as a probe will be more sensitive and accurate.     

幽门螺杆菌PCR检测的研究进展

幽门螺杆菌是急性、慢性胃炎、和十二指肠溃疡的致病菌,并可能与胃癌有关,因此对该菌进行检测在临床上具有重要价值,本文仅就ＰＣＲ应用于该菌检测的标本处理,引物设计,扩增步骤、扩增产物的分析和ＰＣＲ诊断的临床意义等做简要介绍。     

遗传病的检测

加利福尼亚州杜亚特的“希望城”(City of Hope[Duarte,California])的科学家发明了一种可以检测某种遗传病的方法,此法可通过“阅读”人的DNA来测知是否有某种遗传病,预计到年底可在全世界应用。此法已提出了申请技术专利,“希城望”已将研制成套诊断设备的绝对权利授予分子诊断公司——西德BayerAG化学与制药公司的子公司。     

LbCpf1基因的原核表达、纯化与体外切割检测 *

目的:为获得具有体外切割活性的LbCpf1蛋白。方法: 将毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的LbCpf1基因编码区连接至pHis*6(IV),构建原核表达质粒CRISPR-LbCpf1-6*His。将该重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,经镍柱亲和层析纯化、透析除盐和凝胶电泳检测等步骤获得重组蛋白,进行体外切割试验鉴定重组蛋白切割活性。结果: 双酶切鉴定和测序结果表明成功构建重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His,经转化后获得含有重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His的BL21(DE3)蛋白表达菌株。将菌株接种于37 ℃,160 r/min,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导5 h,最终镍柱纯化除盐后的LbCpf1蛋白终浓度可达400 ng/μl,在体外适宜条件下,该重组蛋白可与成熟的crRNA结合切断标靶DNA。结论: 获得的高纯度LbCpf1蛋白具有体外切割活性,可用于后续基因编辑研究。     

光学基因组图谱在染色体结构异常检测中的应用

染色体结构异常（structural variations,SVs）是临床中的常见现象,主要包括染色体缺失、重复、倒位和易位等,因其会引起基因融合、断裂或拷贝数改变,常导致疾病的发生。目前临床上对于SVs的检测多采用染色体核型、芯片分析或高通量测序等细胞遗传学或常规分子遗传学技术。近年来,随着检测技术的不断发展,隐匿性染色体平衡易位和微小片段的异常在产前诊断、新生儿遗传病、血液病及肿瘤等研究领域逐渐被重视,而传统的遗传学检测方法存在较为明显的局限性。光学基因组图谱（optical genome mapping,OGM）是近年来基于全新原理开发的分子遗传学检测技术,与传统技术相比,其对常规和隐匿性SVs（平衡易位、微小片段等）都有较强的检出能力,在多领域有较高的应用价值。但是OGM也存在一定的局限性,如其因灵敏度较高而需要其他手段辅助排除假阳性结果,在近着丝粒等无标记区域无法进行检测等。本文针对传统细胞遗传学检测技术和OGM对SVs的检测能力,OGM的优势、缺陷及其在肿瘤、儿科等领域的应用进行综述。     

一种基于定量PCR的CRISPR/Cas9基因编辑作物快速检测方法的研究

基因编辑技术自诞生以来,在作物育种、基因功能分析中得到了广泛的应用,其中CRISPR/Cas9系统是目前使用最多的基因编辑技术。基于荧光定量PCR技术,针对编辑位点设计特异性探针,结合基因组快速提取方法和成熟的水稻内参基因PLD引物,对自行研发的CRISPR/Cas9系统编辑水稻的Os11N3基因进行检测,并通过合成质粒模拟不同突变情况对该方法的特异性进行了验证。研究所建立的体系可在节约时间和成本的同时获取满足qPCR检测所需的基因组,能够区分1 bp基因编辑突变体与野生型,具有良好的特异性和灵敏度。检测方法可为作物育种筛选节省时间和成本,为基因编辑产品检测监管提供技术支持。