徐闻珊瑚礁自然保护区可培养富脂海洋微藻的生物多样性

从徐闻珊瑚礁自然保护区(20°10′–20°27′N, 109°50′–109°24′E)潮间带采集海水和泥沙样品, 用f/2-medium 培养液富集培养其中的海洋微藻, 采用基于96 孔板的“稀释分配”结合“微吸管剔除”的方法分离培养海洋微藻, 采用微藻形态学观察、18S rDNA 序列分析及其系统进化树构建的方法分析鉴定分离培养的藻株, 采用尼罗红染色法检测和分析海洋微藻细胞中的脂质。目的就是要分析研究徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带可培养富脂海洋微藻的生物多样性, 为富脂海洋微藻的研究开发奠定基础。结果分离、培养、鉴定并储藏了118 株海洋微藻(Genbank 登录号为KU561102 ~ KU561219),含48 个种, 分布于硅藻门(Bacillariophyta)、绿藻门(Chlorophyta)和定鞭金藻门(Haptophyta) 3 个门的6 纲、22 目、24 个科、28 个属。其中, 有37 株为富脂微藻, 含22 个种, 分布于硅藻门和绿藻门2 个门的4 纲、11 目、12 个科、16 个属; 优势属为双眉藻属(Amphora), 含22 株,占分离培养藻株的18.6%; 含脂量最高的种群为辐节藻属(Stauroneis), 含Stauroneis anceps, Stauroneis gracilior, 和2 株Stauroneis kriegeri, 共4 株海洋微藻。这表明徐闻珊瑚礁自然保护区潮间带可培养的富脂海洋微藻的物种丰富多样, 可能是发掘多不饱和脂肪酸和生物柴油的理想资源。     

尼罗红荧光法快速检测培养过程中湛江等鞭金藻的中性脂

研究一种快速准确测定微藻中中性脂的方法。湛江等鞭金藻是一种中性脂含量高且具有开发潜力的能源微藻。以湛江等鞭金藻为实验对象,首先优化尼罗红染色的条件。当二甲基亚砜体积分数为2.0%、尼罗红质量浓度为1.00μg/m L、细胞密度为1.0×106个/m L、激发波长为480 nm、检测波长为580 nm时,优化的染色时间为10min。其次测定了背景荧光对检测的影响。结果表明,在不同细胞状态下,背景荧光强度大约是微藻内荧光强度的20%左右,可以忽略。最后比较了尼罗红荧光法和重量法。结果表明,荧光强度与中性脂含量的相关系数R2=0.946 8,虽然两者相关性并不十分高,但作为一种快速测定微藻中中性脂的方法,尼罗红荧光法依然是研究微藻培养过程中中性脂含量变化的有效方法。     

甘蓝型油菜油体数量及面积之和与含油量的相关性

利用荧光染料尼罗红染色和激光扫描共聚焦显微观察技术, 建立了油菜油体观察或生物体内中性脂类物质定性鉴定的研究体系。对高油品种宁油14号、宁油18号、ZH-088和低油品种ZL-366、NjY008、Westar共6个甘蓝型油菜品种子叶 贮藏细胞内的油体进行了观察。研究发现: 油菜种子成熟过程中, 油体从着色不明显的小颗粒, 逐渐发育形成着色清晰的球状大油体。种子成熟干燥后, 油体间很少发生聚合。在成熟干燥的种子中, 油体集中分布于子叶贮藏细胞中央, 呈椭圆形或不规则形状, 较少为圆形。通过研究种子内油体与含油量的关系, 发现高油品种组与低油品种组之间在单个子叶贮藏细胞内油体数量和截面积之和存在明显差异, 而在高油品种组内或低油品种组内的差异不明显。结果显示, 油菜种子细胞中油体的数量和总面积与含油量之间存在正相关, 可作为高油分材料的选择依据。     

结核分枝杆菌体外休眠模型的建立

目的:模拟结核分枝杆菌体内缺氧和微营养的生长环境建立其休眠模型。方法:将牛分枝杆菌卡介苗野生株BCG菌株在"微需氧+pH5.0+10%Dubos"的条件下培养,以菌株生长停滞,菌体表面脂质体增厚为休眠标准进行鉴定。取不同时间菌株测定600 nm下的吸光度(A)值绘制生长曲线,同时进行金胺O-尼罗红(Auramin-O,Nile Red)双荧光染色和实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR,qRT-PCR)检测休眠相关基因的表达量,确定菌株进入休眠状态。结果:在休眠条件培养过程中,BCG菌株的生长速度与常规条件培养菌株相比明显减慢(P0.01),并且在休眠条件培养中第10、14和18天细菌生长基本接近停滞状态(P0.01);同时金胺O荧光染色显示绿色荧光减弱,尼罗红红色荧光增强;休眠相关基因hspX、devR表达量逐渐上调,且培养第18天菌株明显高于第0天培养菌株(P0.05)。结论:应用"微需氧+p H5.0+10%Dubos"条件培养,以金胺O-尼罗红染色和devR表达为标准,可以成功建立结核分枝杆菌休眠模型。     

裂殖壶菌高产油突变体的高通量筛选

二十二碳六烯酸(DHA)具有促进婴幼儿大脑和视网膜发育等多种生理功能,被广泛应用于食品、医药和养殖等行业。为了获得适合于工业化生产的高产油、高产DHA的裂殖壶菌工程株,文中建立了一套操作简单、快速准确的基于尼罗红染色的高通量筛选方案。首先利用紫外线(UVC)诱变的方式快速构建裂殖壶菌的随机突变体库。然后采用优化后的筛选条件如裂殖壶菌的最佳尼罗红染色条件(二甲基亚砜浓度为20%,尼罗红终浓度为2.0μg/mL,孵育时间为10 min,孵育温度为40℃)和更合理的筛选依据(多功能酶标仪实现高通量测量的单位细胞密度油脂量)等,对3 648株突变体进行筛选,得到了3株高产油突变体(D03432、D05106和D01521)。摇瓶发酵实验表明,这3株突变体在生物量、油脂含量和DHA产量上均高于野生型菌株,其中突变体D03432和D05106的油脂量分别达到了干重的64.74%和63.13%,远高于野生型菌株的43.19%。而且这两株突变体的DHA产量分别是野生型菌株的2.26倍和2.37倍。最后,对突变体D03432和D05106进行了5 L发酵罐发酵培养,相较于野生型菌株,这两株突变体不仅生物量和油脂含量有所增加,而且DHA产量更是分别增加了45.5 1%和66.46%,展现出较好的工业应用潜力。此外,本筛选方案对其他产油微生物高产油突变体的高通量筛选具有借鉴作用。     

尼罗红在测定细菌细胞中聚-β-羟基丁酸和其他脂类贮藏物质中的应用

通过对含有PHB和非PHB(脂类贮存物质(NPLD)的细菌细胞的尼罗红染色和荧光显微观察,证实尼罗红是一种很好的细菌细胞内贮存的脂类物质的荧光染色剂,灵敏度较高.可用于PHB和非PHB脂类贮藏物质荧光显微观察,并能在一定程度上将两者区分开来.     

基于尼罗红染色分析金藻总脂动态积累

通过尼罗红荧光染色对一株富油微藻金藻Isochrysis sp. CCMM5001建立和完善了一种方便快捷且能准确定量金藻油脂含量的方法,利用该方法探索了不同培养条件对金藻生长和总脂积累的影响。结果表明:经尼罗红染色后,金藻的单细胞荧光强度与其总脂含量呈良好的线性关系;金藻最适生长的氮浓度、光照强度和温度分别为1323 mol/L、148.0 mol/（m2s）、25℃;最适总脂积累的氮浓度、光照强度和温度分别为441 mol/L、92.5 mol/（m2s）、15℃;优化培养条件并采用两阶段培养法后总脂含量和油脂产率都有大幅提高,可分别高达63.3%和22 mg/（Ld）。       

尼罗红染色法筛选产油酵母及定量检测胞内油脂含量的研究

【目的】建立产油酵母筛选以及胞内油脂含量测定的简便方法。【方法】利用尼罗红与胞内油脂成分结合后在紫外光照射下发出荧光且荧光强弱与油脂含量相关的原理。通过在添加尼罗红的培养基中培养酵母,并观察菌落荧光的方法对385株深海酵母进行产油脂菌株筛选,利用26S rDNA D1/D2区序列分析方法对筛选获得的产油酵母菌株进行鉴定,并以其中的一株高产油脂酵母(2A00015)为试验菌株,建立了一套尼罗红染色快速测定油脂含量的方法。【结果】获得22株产油酵母,其中油脂含量最高可达62.9%,经分子鉴定后显示这22株酵母分别属于(Candida viswanathii)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)以及Rhodosporidium paludigenum酵母。尼罗红染色快速测定油脂含量方法的最佳检测条件为:菌悬液OD600小于1.2,尼罗红浓度0.5 mg/L,染色时间5 min,激发波长488 nm,发射波长570 nm。该测定方法得到相对荧光强度与称重法得到油脂含量呈正相关性,R2=0.9637。     

尼罗红荧光优化法快速检测微拟球藻细胞内油脂含量

【目的】利用尼罗红荧光染色法快速检测微拟球藻细胞内的油脂含量。【方法】系统性地调整激发波长与发射波长,确定最佳二甲基亚砜(DMSO)浓度、尼罗红终浓度、染色时间和细胞密度的范围,比较重量法和Triolein标准品的油脂含量分别与荧光强度之间的关系。【结果】分析得出了尼罗红荧光强度与微拟球藻细胞油脂含量的关系,确定优化后染色条件为:二甲基亚砜浓度为5%,尼罗红终浓度为1 mg/L,染色时间为6 min,且细胞密度为(0.5-3.0)×10~6 cells/m L的范围内,激发波长和发射波长分别为515 nm和570 nm。重量法和Triolein标准品的油脂含量分别与尼罗红染色荧光强度之间的关联性,表明尼罗红荧光染色方法可以用来快速准确地检测细胞内的油脂含量,且油脂含量与荧光强度之间正相关,相关系数R~2为0.997 3。尼罗红染色优化后油脂的检测下限达到2μg,大大减少了测定油脂含量所需细胞量。【结论】针对不同种属系统性地确认了荧光激发波长和发射波长,并优化验证得到了最佳尼罗红荧光染色条件,可以快速准确地检测微量微拟球藻细胞内的油脂含量,便于大规模筛选高产油突变藻株。