杆状病毒凋亡抑制基因IAP1促进家蚕CyclinB的核内积累

[目的]家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是生产上危害最严重的病原之一。BmNPV感染BmN-SWU1细胞将细胞周期阻滞于G2/M期。CyclinB是调控细胞周期G2期向M期转换的重要细胞周期蛋白。因此,研究BmNPV感染后CyclinB变化对解析病毒调控细胞周期的机制具有重要意义,同时探究这个过程中与CyclinB互作的病毒蛋白,可为构建家蚕转基因品系提供分子靶标。[方法]qRT-PCR检测BmNPV感染后BmCyclinB的表达变化;免疫荧光观察病毒感染前后BmCyclinB的定位变化,通过细胞质细胞核蛋白分离实验验证。免疫共沉淀钓取与BmCyclinB互作的病毒蛋白。BmNPV感染期间敲除BmNPV IAP1观察BmCyclinB的入核比例。[结果]BmNPV感染后BmCyclinB转录水平下调。BmNPV感染前BmCyclinB主要定位于细胞质,而感染后主要定位于细胞核。BmNPV感染BmN-SWU1细胞后促进BmCyclinB在核内积累。共钓取了7个与BmCyclinB互作的病毒蛋白,免疫共沉淀和细胞共定位证明BmNPV IAP1与BmCyclinB之间存在相互作用。敲除BmNPV IAP1后BmCyclinB进入细胞核的数量显著减少。[结论]BmNPV IAP1可通过与BmCyclinB互作,促进BmCyclinB在核内积累。     

家蚕核型多角体病毒lef-11基因RNA干扰策略的优化

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)lef-11基因作为杆状病毒高度保守的晚期表达因子之一,对病毒晚期基因的表达极其重要。因此对lef-11基因进行有效RNA干扰将提高宿主细胞对BmNPV的抗性。【方法】本文基于经典的sh-RNA-loop骨架及家蚕内源性的miRNA骨架,构建以BmNPV lef-11基因为靶标的干扰载体pIZ-shRNA1、pIZ-shRNA2和pIZ-Ds RedamiR279;分别构建基于A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4和hsp70启动子驱动的干扰载体,用以评价不同启动子驱动的干扰载体的抗病毒效果,并对干扰载体进行优化。【结果】首先,本文通过比较miRNA-based和shRNA-based RNAi载体对同一靶基因同一位点的干扰效率,发现pIZ-Ds Red-amiR279对BmNPV lef11基因的干扰效率超过90%,远优于shRNA-based RNAi载体的干扰效果;其次,通过对干扰载体进行优化,发现IE1启动子的效果最优,由其驱动的pIZ-Ds Red-milef11干扰载体也是本研究中的最优干扰载体,对病毒的增殖抑制效果最为明显。【结论】对目的基因的干扰效果并非启动子的活性越高、miRNA积累得越多就越好,只有综合考虑干扰片段的选择、启动子的活性以及靶基因自身的功能等多方面的因素,才能提高干扰效率,达到干扰目的。     

人食管癌EC9706单克隆的分离培养及其生物学特性的研究

用限制性稀释法对食管癌EC9706细胞系进行单细胞克隆分离,建立了3个亚系,分别命名为EC1、EC2和EC3。细胞遗传学分析显示,EC1仍为混合克隆,EC2和EC3的染色体众数分别为117条和62条。对EC2和EC3的生物学特性进行比较,生长曲线、平皿集落形成能力实验、流式细胞分析和细胞运动能力实验均表明,两者的恶性程度有显著差别,EC2较低,EC3较高。成功分离的2个食管癌单克隆细胞亚系,可为食管癌发生发展的分子机制研究、基因治疗研究、耐药机制研究以及抗肿瘤药物筛选提供实验材料。     

用显微光度图像分析系统研究谷子胚性细胞系的GDH细胞类型分布

由显微光度图像分析与细胞化学技术对不同实验材料和不同培养时期谷子胚性细胞系的谷氨酸脱氢酶（ＧＤＨ）细胞类型分布表明：从单细胞群体水平（细胞类型分布）研究胚性细胞系可以比较准确地了解其所处的生理状态;胚性细胞系的细胞类型分布可以作为其是否适于原生质体培养的指标之一;细胞类型分布也适用于组织培养和原生质体培养一些问题的研究。     

家蚕肠道细菌群体调查与分析

目前,环境微生物中绝大部分是无法获得纯培养的。为了比较全面地了解家蚕肠道的细菌群体结构,研究采用了非培养法和传统培养法相结合的方法进行调查分析。非培养法是先直接提取家蚕肠道中的微生物群体基因组DNA,用PCR法扩增细菌16S rRNA基因,建立16S rDNA文库;再以限制性片段长度多态性(RFLP)方法从文库中筛选可能不同细菌来源的克隆,并测定其核苷酸序列。将所获得的序列与GenBank数据库进行BLAST比对分析,并通过系统发育分析,推测它们可能代表的细菌种属,以及对家蚕生长发育所起的作用。结果表明,家蚕肠道中的细菌主要是节杆菌属、乳杆菌属、大肠杆菌属、芽胞杆菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属。它们在家蚕消化利用桑叶和疾病预防中可能有着重要意义。非培养法和培养法均有各自的长处和不足,两者具有较强的互补性。     

家蚕与蓖麻蚕杂交后代变异机理探讨:基因组RAPD检测

采用24种随机引物, 对以蓖麻蚕精子进行人工授精得到的家蚕后代中的3个稳定变异品系及其亲本的基因组进行了RAPD检测, 结果显示,在变异品系的RAPD图谱中, 不仅存在大量与母本相同的“亲本带”,同时还出现了不同数量与母本不同的“变异带”,包括“非亲本带”、“缺失带”及个别仅与父本相同的“目的带”,从分子水平上揭示了变异品系存在着明显的“偏母性”与“变异性”特点。 Abstract:Twenty-four random primers were used to analyze the genomes of three descendant strains with steady hereditable variation produced form domesticated silkworm by artificial insemination with sperms of eri silkworm.The results show that in the RAPD patterns there are are many amplified bands called “parental bands” which are similar to those of the female parent.At the same time,there appears varied amount of amplified bands called“variant bnads”that are different from those of the female parent.The variant bands include non-parental-bands,lost-bands and several“expected-bands”which only shared with the male parent.This research reveals the significant matrocliny and variation in the descendant strains at the mole     

白血病抑制因子mRNA的表达受雌激素的调控

运用RT-PCR方法检测了体外培养的大鼠成骨样细胞Ros 17/2.8在17β雌二醇(E2)刺激前后细胞中一些细胞因子的mRNA水平。发现在E2刺激后,细胞中白血病抑制因子(LIF)的mRNA水平明显上升,且呈现E2浓度依赖的特点。该结果提示,LIF可能参与替代性治疗过程中雌二醇对于骨质硫松症的缓解作用。这为进一步研究细胞因子与骨质疏松症的相关性,阐明细胞因子在骨代谢中的作用打下了基础,并将有利于发展治疗骨代谢疾病的药物。 Abstract　With RT-PCR techniques,we examined the expression pattern of some cytokines in rat osteoblast-like cell line ROS 17/2.8, which was stimulated with 17 β-estradiol. After treatment, the obvious increase of LIF(Leukaemia Inhibitory Factor)mRNA level in the cell was observed. It indicates that LIF may involve in the estrogen replacement treatment of osteoporosis. This work will found the base for clarifying the relationship between expression of cytokines and bone remoldeling, and may even facilitate the developement of drug for bone metabolism abnormality.     

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1AC毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1C产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。     

EGCG铜离子络合物对结肠癌细胞内活性氧水平的影响

本文主要通过荧光探针结合流式细胞术,探讨了表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)铜离子络合物(ECC)对结肠癌细胞(RKO细胞)内活性氧水平的影响,并进一步从分子水平阐述了其影响机制.结果表明,5～10 mg/L的ECC能够显著增强胞内活性氧水平,并且随着ECC水平的增加,细胞周期主要阻止于G2/M期.另外,胞内黄嘌呤氧化酶活性呈降低趋势,并且超氧化物岐化酶-1活性并没有随着其基因水平的增强而显著增强;但过氧化氢酶虽然基因水平有了较大的提升,其在胞内的生物活性却呈现出显著性剂量依赖性降低.因此,胞内活性的提升可能主要归因于胞内活性氧(过氧化氢)未能及时被活性降低的过氧化氢酶清除所致.     

家蚕氨肽酶和类钙粘蛋白与苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素相互作用

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis生产的晶体毒素被广泛用作农林害虫的杀虫剂。鳞翅目昆虫受体蛋白是阐明其与晶体毒素相互作用的重要模式。文中纯化了苏云金芽孢杆菌的晶体毒素蛋白,质谱鉴定为Cry1Ac毒素,然后重组表达家蚕氨肽酶N (BmAPN6) 和类钙粘蛋白 (CaLP) 结合结构域。利用免疫共沉淀、Far-Western印迹和酶联免疫吸附试验,证明Cry1Ac毒素蛋白和BmAPN6之间的相互作用。在Sf9细胞中,对Cry1Ac毒素的细胞毒活性分析,表明BmAPN6参与Cry1Ac毒素诱导的细胞形态异常和裂解死亡。文中也利用相同的方法,对钙粘蛋白的3个结合位点CR7、CR11和CR12进行相互作用分析,结果表明3个重复结构域是CaLP的Cry1Ac结合位点。上述结果表明,BmAPN6和CaLP可作为Cry1Ac毒素致病的功能性受体,为进一步揭示晶体毒素的致病机制和基因编辑增强家蚕抗病性提供了研究靶标。