实时荧光PCR技术诊断人偏肺病毒检测效果分析

目的：比较实时荧光PCR检测技术与直接免疫荧光检测技术及间接免疫荧光检测技术在呼吸道人偏肺病毒（hMPV）的检测效果,探讨实时荧光PCR检测技术的应用前景。方法：选取2010年4月至2013年1月因呼吸道感染在我院儿科门诊和住院部接受治疗的患儿鼻咽分泌物标本,共831份（男523例,女308例）。标本按年龄分0~6月龄（68例）、6月~1周岁（153例）、1~3周岁（281例）、3~6周岁（198例）、〉6周岁（131例）五组。采用实时荧光PCR检测技术与直接免疫荧光检测技术及间接免疫荧光检测技术进行检测与分析。结果：采用实时荧光PCR法共检测出221例hMPV阳性（26.6%）,直接免疫荧光法检出121例hMPV阳性（14.6%）,二者相比有统计学意义（X2=5.19,P〈0.05）;间接免疫荧光法检测出103例HMPV阳性（12.4%）与实时荧光PCR法相比有统计学差异（X2=7.17,P〈0.05）;1~3周岁组hMPV感染率与其它组相比差异有统计学意义（X2=12.89,P=0.01）。结论：实时免疫荧光技术hMPV的检测率明显高于直接免疫荧光法和间接免疫荧光法,对hMPV具有很高的临床诊断价值。     

唑来膦酸治疗原发性骨质疏松症的效果观察

目的：研究唑来膦酸在治疗原发性骨质疏松症过程中患者骨密度及疼痛的变化。方法：设计为期两年的随机、前瞻性研究,通过Achilles定量超声（QUS）系统测量骨密度（BMD）,进行问卷调查、疼痛评估,共入选60例原发性骨质疏松症患者。随机分为唑来膦酸组和对照组,唑来膦酸组使用唑来膦酸及元素钙治疗;对照组使用元素钙治疗。治疗前后分别进行骨密度测定及疼痛评估,进行对比研究。结果：治疗两年后.与治疗前比较,唑来膦酸组BMD上升（P〈0.05）;对照组BMD无明显变化（P〉0.05）。两组临床获益率分别为73.33%和46.67%,无显著差别（P〉0.05）。结论：唑来膦酸治疗原发性骨质疏松症有良好作用,能提高骨密度,对骨质疏松的治疗及预防骨折具有重要的意义。     

天山雪莲SikGLP基因的克隆及表达分析

从天山雪莲cDNA文库中分析得到一个类萌发素蛋白基因序列,命名为SikGLP。生物信息学分析表明,该基因包含1个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸。SikGLP分子量为21.6 kDa,理论等电点是6.81,并且是具有信号肽的疏水性蛋白。氨基酸多序列比对发现GLP序列保守性较高,具有的GLP的典型特征。17个物种间的系统发育树可以看出与葡萄GLP进化关系最近。Real time-PCR检测表明,SikGLP基因受低温、甲基紫精和PEG诱导表达,可能在胁迫初期对提高植物防御起作用。     

miRNA-125在肝癌中表达变化的研究

目的:探讨微小RNA(miRNA)-125在正常人和肝癌患者血清,以及肝癌患者正常肝脏组织和肝癌组织中的表达.方法:应用荧光实时定量PCR方法检测miRNA-125,包括miRNA-125a、miRNA-125b在正常人和肝癌患者血清中的含量.同时收集并检测肝细胞癌患者术中取得的正常肝脏组织和癌症组织miRNA-125含量.结果:1)与正常人血清相比,miRNA-125在癌症患者血清中的含量没有明显变化.2)与正常肝脏组织相比,肝癌组织中miRNA-125含量明显下调,有统计学差异(P＜0.001).结论:MiRNA-125,包括miRNA-125a和miRNA-125b在肝癌组织中表达显著减少,但是在肝癌患者血清并没有明显变化.     

实时荧光定量PCR检测癫痫发生中大鼠海马MEF2及CDK5的表达

目的:检测大鼠在癫痫发生过程中不同时间点海马肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor,MEF2) mRNA及细胞周期素依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5) mRNA的表达水平,并分析两者之间的相关性.方法:采用锂-匹鲁卡品腹腔注射,建立大鼠慢性癫痫模型,提取海马组织中的总RNA,并逆转录为cDNA,应用Real-time PCR检测MEF2及CDK5 mRNA的表达量.结果:MEF2A/2D mRNA于造模中止后1d急剧下降,3d开始上升,至4w达最高,后渐恢复至正常水平;CDK5 mRNA的表达量在整个癫痫发生过程中均呈上升趋势,4w达最大,6w开始下降,8w恢复至正常水平.结论:MEF2与CDK5均参与了慢性癫痫的形成过程,但两者的表达量在时间上无明显关联性.     

miRNA-181在肝癌中表达变化的研究

目的:观察微小RNA(miRNA)-181在正常人肝细胞L02、肝癌细胞株SMMC7221和Hep3B中的表达,以及在正常肝脏组织和肝癌组织中的表达,探讨其与肝癌发生发展的关系.方法:应用荧光实时定量PCR方法检测miRNA-181,包括miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c、miRNA-181d,在正常肝细胞和肝癌细胞的含量.同时收集并检测肝细胞癌患者术中取得的正常肝脏组织和癌症组织的含量.结果:MiRNA-181在肝癌细胞株中的表达明显高于正常人肝细胞(P＜0.05或P＜0.001).MiRNA-181在肝癌组织中表达明显高于正常肝脏组织(P＜0.05).结论:MiRNA-181在不同肝癌细胞株中表达不同,但都高于正常肝细胞,并且miRNA-181在肝癌组织中的表达高于正常肝脏组织.这说明miRNA-181与肝癌的发生发展有相关性,可能成为肝癌诊断和预后的一个指标.     

miRNA-492在肝癌中表达变化的研究

目的:通过观察miRNA-492在肝细胞株L02、肝胚细胞瘤HepT1细胞株和肝癌SMMC-7721细胞株中的表达差异,以及在正常肝脏组织、肝母细胞瘤组织和原发性肝癌组织中的含量差异,探讨其与不同类型肝脏肿瘤发生发展的关系.方法:应用Real time-PCR方法检测miRNA-492在正常L02肝细胞株和肝癌HepT1、SMMC-7721细胞株的含量.同时采集和检测原发性肝癌患者术中取得的正常肝脏组织和癌症组织,以及肝母细胞瘤患者瘤组织的含量.结果:1)与正常人L02肝细胞相比,miRNA-492在肝癌HepT1细胞株中的表达显著升高(P＜0.001),但在SMMC-7721细胞株中略升高,无统计学差异.2)与正常肝脏组织相比,miRNA-492在肝母细胞瘤的瘤组织中含量显著升高(P＜0.01),但原发性肝癌的癌组织略升高,无统计学差异.结论:miRNA-492在不同肝癌细胞株中表达不同,在肝胚细胞瘤中表达升高,且在肝母细胞瘤瘤组织中的表达高于正常肝脏组织.但原发性肝癌癌组织中变化不明显,这说明miRNA-492与某些类型肝癌,特别是肝母细胞瘤的发生发展有关.     

奥利亚罗非鱼髓样分化因子(MyD88)的克隆及其在组织中的表达

髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88,MyD88）是TLR（toll-like receptor）信号通路的关键接头蛋白,在先天性免疫中具有重要作用。通过RACE-RCR技术克隆了奥利亚罗非鱼（Oreochromis aureus）MyD88基因cDNA全长序列（GenBank登录号：JN032017）。序列分析表明,奥利亚罗非鱼MyD88 基因全长为1 611 bp,其中包括155 bp的5’非编码区,589 bp的3’非编码区和867 bp的编码区,编码288个氨基酸残基。MyD88蛋白N端具有死亡结构域,C端具有TIR结构域。同源性分析表明,奥利亚罗非鱼MyD88氨基酸序列与鳜鱼（Siniperca chuats）相似性最高,为85.8%,与其他鱼类相似性为70%~82%,与哺乳动物相似性为63%~66%;系统进化树分析表明,奥利亚罗非鱼MyD88与同属鲈形目的鳜鱼、大黄鱼（Larimichthys crocea）聚在一起。采用实时定量PCR方法检测MyD88在奥利亚罗非鱼各组织中的表达情况。结果显示,MyD88在所有被测组织中都有表达,其中表达量最高的是卵巢,其次在小肠、脾、肝、肾、鳃和血液中有较高的表达量,肌肉、精巢组织中表达量最低。本研究可为进一步探讨MyD88在奥利亚罗非鱼TLR信号通路中的作用奠定一定的基础。     

Cu胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因表达的影响

采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以18S rRNA为内参基因,研究了Cu胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗错配修复相关基因(MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7)表达的影响,并结合幼苗的形态和生理指标,选取Cu胁迫敏感的生物标记物.结果表明,Cu处理10 d后,对拟南芥种子发芽率、地上部鲜重及叶绿素含量的影响不大;根的长度明显受到抑制;拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质含量随着Cu浓度增加明显降低;5个错配修复相关基因的表达均受到不同程度的抑制,Cu浓度与拟南芥幼苗上述指标之间存在明显的剂量-效应关系.以上结果表明,地上部可溶性蛋白含量变化与上述错配修复相关基因表达量的改变趋势一致,且均对Cu胁迫较敏感,可以作为检测Cu污染对植物遗传毒性效应的生物标记物.     

双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。