人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价.结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%.上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份.对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性.本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段.     

小鼠饲养过程中蛋白质组的整体重稳定性同位素标记

文中探讨了稳定同位素代谢标记(SILAC)定量技术在哺乳动物模型上的应用,建立了可用于疾病模型比较蛋白质组学研究的定量内标。用含1%13C6-Lysine的SILAC鼠粮饲养C57BL/6J雌性小鼠,记为F0代,通过与雄性小鼠交配繁殖出F1代,相同方法繁殖出F2代标记小鼠。分离F2代小鼠的大脑、肺脏、心脏、胃、小肠、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉组织,提取各组织的全蛋白,进行蛋白酶Lys-C酶切,利用高效液相色谱串联质谱联用技术(LC-MS/MS)进行鉴定和定量分析。对蛋白质定量结果进行高斯拟合确定均值及标准差,得出不同脏器和小鼠整体的标记效率,肝脏的标记效率最高,为96.34%±0.90%;大脑标记效率最低,为92.62%±1.98%,小鼠整体标记效率为95.80%±0.64%,符合SILAC标记效率不低于95%的国际标准。成功地将SILAC方法从微生物和细胞系水平拓展到哺乳动物模型,这为基于动物模型研究疾病发生、发展机制提供了有力工具。     

GST-Ccd1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：利用大肠杆菌DH5α表达GST—Ccd1融合蛋白,并用亲和层析分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法：利用本室构建好的pGEX-5X-1-Ccd1-N原核表达重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达。经谷胱甘肽Sepharose 4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到Ccd1的兔源多克隆抗体。结果：ELISA结果显示血清抗体效价可以达到1∶40 000。免疫组化分析表明自制的抗体能特异性与Ccd1蛋白相互作用,可以用于实验分析。结论：制备了效价高特异性良好的抗Ccd1多克隆抗体,经实验验证获得的抗体能够满足针对Ccd1的免疫印迹和免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究Ccd1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有用的实验工具。     

Establishment of an ELISA to Detect Kaposi＇s Sarcoma-associated Herpesvirus Using Recombinant ORF73

Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is causally related to Kaposi's sarcoma (KS),primary effusion lymphoma (PEL) and a proportion of cases of multicentric Castleman's disease (MCD). The ORF73 protein was cloned into pQE80L-orf73 and expressed in E.coli and purified. The expressed recombinant ORF73 was identified by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protein of about 27 kDa was expressed as expected. Western Blotting showed that the purified recombinant ORF73 reacted with KSHV positive serum. The immunogenicity of the recombinant ORF73 was further analysed by ELISA and the optimal conditions were determined. The ORF73 ELISA was used to compare the KSHV seroprevalence between Hubei and Xinjiang Han people. The Hart people in Xinjiang have significantly higher KSHV seroprevalence than their counterparts in Hubei (6.7% vs 2.9%, P = 0.005).     

若干苄基异喹啉类化合物的HPLC保留因子与抑制钙调素活性的关系

苄基异喹啉类化合物具有较强的拮抗钙调素(Calmodulin,Cam)的活性,测定这类化合物HPLC参数LogK′作为疏水参数与抑制钙调素的活性进行相关分析,结果表明活性随化合物亲脂性的增大而升高,二者较符合抛物线关系。     

太子参花叶病毒的检测与防治

1982年我们在国内外首次发现太子参花叶病毒,并对该病毒的形态结构、症状表现、宿主范围、血清学、生化特性等进行了研究,同时还对太子参病毒病进行了初步防治。在上述工作的基础上,我们又进一步应用ELISA技术,对太子参花叶病毒进行了田间检测,并确认了种子消毒方法,为太子参花叶病毒病的田间诊断与防治提出了科学措施。     

人C1酯酶抑制剂抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的 建立C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor, C1-INH)抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,验证后用于C1-INH纯化工艺摸索。方法 用羊抗人C1-INH抗体作为捕获抗体,用过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人C1-INH抗体作为检测抗体,进行棋盘滴定初步确定捕获抗体的工作质量浓度,用西门子血浆标准品进行系列稀释作为标准品经过2轮实验来确定拟合曲线和线性范围及检测抗体的工作质量浓度,用血浆标准品标定电泳C1-INH标准品(电泳纯度>92%),分析与血浆标准品的平行性来选择本方法最终使用的标准品,最终建立了C1-INH抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法。对此方法进行线性、准确度、精密度、加样回收率、电泳标准品稳定性的验证。将验证后的方法用于C1-INH纯化工艺的摸索及产品质量分析,并与特定蛋白检测仪的结果进行比较。结果 捕获抗体质量浓度为400.000 ng/mL,检测抗体质量浓度为400.000 ng/mL,标准曲线采用四参数方程拟合,电泳标准品的质量浓度为0.895 mg/mL,血浆标准品作为本方法标准品;标准曲线的线性范围为1.560～100...     

基于GIS的青藏高原生态服务功能定量评价

生态系统服务是保障人类生存发展的重要支柱和实现区域可持续发展的重要保障。基于植被净初级生产力(NPP)定量指标评估法、GIS空间分析法、生态服务功能综合评价法与一元线性回归趋势线法,对2000—2015年青藏高原水源涵养、水土保持、防风固沙和生物多样性维护功能的空间分布特征及重要性进行评价。结果表明:(1)水源涵养、水土保持、防风固沙、生物多样性维护功能指数东南高、西北低,呈现出由东南向西北递减的变化趋势;(2)从上述生态服务功能重要性分级特征来看, 4类生态系统服务功能一般区面积最大,分别占高原总面积的27.06%、19.73%、61.44%、41.7%;生态服务功能较弱的区域面积最小,分别占高原总面积的16.47%、16.96%、0.97%、4.06%;(3)从综合重要性分级特征看,生态系统服务功能一般区面积最大,占高原总面积20.72%,生态系统服务功能较弱区面积最小,占高原总面积的16.73%,总体上综合评价结果优于单一生态功能评价;(4)2000—2015年来青藏高原生态功能总体上呈现两大明显特征,即高原南部、三江源区域、青海湖南端及祁连山地区综合生态服务功能呈下降趋势,藏北...     

脊髓灰质炎病毒合成肽的免疫诱导作用

 本文报道了模拟脊髓灰质类Ⅰ型病毒Mahoney株外壳蛋白的氨基酸顺序,用化学方法合成了位于VP1 70～75、95～102、93～103、70～75+93～103和VP 3132～143的五段肽。合成的肽段与载体蛋白偶联后免疫家兎能产生明显的免疫记忆作用。结果表明这些合成肽均能被脊髓灰质炎多克隆抗血清所识别,具有一定的免疫原性。