高通量测序技术在遗传性耳聋研究中的应用及研究进展

耳聋是一种常见的严重出生缺陷,阐明遗传性耳聋的致病机理不仅能够在临床上辅助诊断,为遗传咨询及耳聋预防提供依据,而且能促进人们更深入地了解耳聋的致病机制,开发新的治疗方法。随着基因组研究技术不断创新,以全基因组测序、全外显子组测序、目标区域测序为代表的高通量测序技术在遗传性耳聋研究中已得到广泛应用。本文总结了近5年全外显子组测序和目标区域测序在遗传性耳聋致病基因研究及临床分子诊断中应用及研究进展,希望能够有助于我国临床耳聋基因诊断技术的发展及诊断水平的提升。     

Hippo信号通路结构生物学研究进展

生物体内存在多种信号转导通路参与发育调控和组织稳态维持等重要过程,其信号异常与多种疾病特别是癌症的发生和发展密切相关。进化上高度保守的Hippo信号通路在个体发育和稳态平衡中发挥极为关键的作用。Hippo信号通路主要通过一系列相关激酶的相互作用和级联磷酸化来传递信号,能抑制细胞增殖并促进凋亡,在很多组织器官中控制细胞数量和器官大小。Hippo信号通路在一系列恶性肿瘤中出现显著异常,被认为是癌症治疗和再生医学的重要靶标。目前,Hippo信号通路中大部分关键组分已经确定,而其具体信号调控机制及功能正在完善之中。本文总结了目前已知的Hippo信号通路各蛋白成员的结构信息,重点从结构生物学角度对其信号的转导与调控机制进行分析,并对已有的Hippo信号通路靶向小分子及多肽抑制剂进行梳理,以期深化人们对该通路关键蛋白质机器的理解,并进一步促进相关的功能研究和潜在的治疗干预研发。     

Western blot免疫印迹法检测磷酸化蛋白表达条件优化研究

目的:探讨Western blot免疫印迹法不同转膜方法和不同抗原抗体比例对磷酸化蛋白表达的检测效果。方法:选择肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)及其磷酸化蛋白作为研究对象,比较半干转印法、湿转法和1:3000、1:5000、1:10000等抗体稀释比例对磷酸化蛋白检测效果的影响。结果:半干转印法(恒压16V,30 min)观察到蛋白信号断续;而同样样品利用湿转法(恒压130 V,1h)检测发现信号连续且强度明显增高;对于磷酸化蛋白,半干转印法无法观察到磷酸化蛋白信号;而同样样品湿转法检测出现连续信号。统一利用湿转方法进行后续蛋白磷酸化检测,当抗体稀释比为1:3000时,结果出现非特异性条带;降低抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带,且蛋白信号效果较好;抗体稀释比为1:10000时条带图像出现弥散且背景较高。结论:选择合适的转膜方式和抗原抗体比例有助于磷酸化蛋白表达检测。     

重症手足口病合并脑炎患儿血清VCAM-1, VEGF水平及其临床意义

目的:分析重症手足口病合并脑炎患儿血清血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)水平及其临床意义。方法:以2013年1月至2016年5月我院诊治的手足口病患儿90例为研究对象,根据是否合并脑炎将其分为观察组(合并脑炎)45例、对照组(未合并脑炎)45例。观察组中重型22例,危重型23例。统计分析患儿脑脊液常规分析指标(脑脊液蛋白质、脑脊液白细胞计数)水平及脑脊液和血清中VCAM-1、VEGF水平。结果:观察组患儿入院时脑脊液中蛋白质、白细胞计数水平,脑脊液和血清中VCAM-1、VEGF水平均显著高于对照组(P0.05),观察组中,危重症患儿的脑脊液白细胞计数和脑脊液中VCAM-1水平显著高于重症患儿,差异有统计学意义(P0.05),危重症患儿的脑脊液蛋白质、血清VCAM-1、VEGF水平、脑脊液VEGF均高于对照组,但差异无统计学意义(P0.05)。患儿血清VCAM-1水平与脑脊液蛋白质、白细胞计数和VCAM-1水平均呈显著正相关(相关系数r=0.852,0.791,0.775,P0.05),患儿血清VEGF水平与脑脊液蛋白质、白细胞计数和VEGF水平均呈显著正相关(相关系数r=0.809,0.882,0.813,P0.05)。结论:重症手足口病合并脑炎患儿血清和脑脊液中VCAM-1、VEGF水平显著上调,且均与脑脊液蛋白质、白细胞计数和VEGF水平显著相关,对于重症手足口病合并脑炎的辅助诊断具有重要的临床意义。     

转香蕉MaASR1基因的拟南芥株系在干旱胁迫条件下的表达谱分析

干旱是最重要的环境胁迫,香蕉MaASR1基因在植物响应逆境胁迫时发挥着重要作用,为了深入研究MaASR1基因的过表达使拟南芥抗旱的分子机制,利用全基因组表达芯片来广谱的筛选MaASR1基因转入后自然条件下及干旱处理条件下差异基因的表达情况。对基因芯片的结果进行了详细的生物信息学分析及相关基因的RT-PCR验证,结果表明MaASR1基因异源表达的拟南芥株系在自然生长条件下共有747个差异基因,其中上调基因559个,下调基因188个;在干旱胁迫条件下共得到653个差异基因,其中上调基因256个,下调基因397个;MaASR1基因的转入可以通过影响激素、光合作用、锌指蛋白及不依赖ABA途径的DREB2A等相关基因的表达来提高拟南芥的抗旱性。为解析MaASR1基因作为转录因子提高植物抗旱能力的分子机制奠定基础。     

进化与未进化小球藻响应苯酚的转录组学分析

苯酚是工业废水中典型的环境污染物。小球藻(Chlorella sp.)由于其生长快、抗逆性强,可以有效利用废水中的酚类化合物,是最有潜力的含酚废水处理藻株。但是高浓度苯酚产生的氧化压力会造成小球藻细胞的氧化损伤。通过实验室适应性进化已经得到了可以耐受500mg/L苯酚的小球藻藻株(L5)。通过无参比较转录组学数据,在基因组尺度上考察了原始小球藻(L3)和进化后小球藻对高浓度苯酚的响应差异。无参比较转录组学结果表明,进化后小球藻能够耐受并降解高浓度苯酚是多个代谢途径整体调控的结果。相比于原始小球藻,进化后小球藻在500mg/L苯酚浓度下对苯酚氧化胁迫的响应增强,主要体现在细胞信号转导、ABC转运蛋白、热休克蛋白、氮代谢和三羧酸循环(TCA)等相关的转录水平明显上调。进化后小球藻通过这些响应降低高浓度苯酚产生的氧化压力。     

小麦光温敏雄性不育系BS366铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶(SOD,superoxide dismutase)是植物中一种主要的抗氧化酶,在植物应对逆境胁迫及抗衰老中起重要作用。本研究从基因芯片数据中筛选获得小麦Cu/Zn-SOD基因的EST序列,通过序列比对后拼接得到小麦Cu/Zn-SOD的候选基因,利用PCR技术在小麦光温敏雄性不育材料BS366中克隆并获得该基因。通过对Cu/Zn-SOD基因序列进行生物信息学分析,结果表明,该基因拥有连续且完整的开放阅读框,长495bp,编码164个氨基酸。氨基酸序列分析发现,该蛋白具有保守的Cu/Zn-SOD功能结构域与典型的Cu/Zn-SOD三维结构,且定位于细胞质中。通过同源进化分析表明,该蛋白与二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)Beauv.)和大麦(Hordeum vulgare L.)的Cu/Zn-SOD蛋白亲缘关系较近,相似度分别为89%和94%。利用实时荧光定量PCR技术对其在小麦不同组织的表达特异性及不同逆境胁迫下的表达模式进行分析,结果表明,该基因在根、茎、叶、雌蕊、雄蕊、颖壳中均有表达,属于组成型表达,且在小麦的地上部含叶绿体的组织中含量较高;同时受多种胁迫诱导,可能参与了多种胁迫诱导调控途径。通过对该基因在不同育性环境中BS366育性转换期花药中的表达模式分析,发现可育环境下,在小孢子母细胞时期和减数分裂期的表达量分别约为对照的8倍与16倍;而不育环境下,该基因表达水平无明显变化。因而推测,小麦Cu/Zn-SOD基因可能参与了光温敏雄性不育系BS366的育性调控。本研究为深入研究Cu/Zn-SOD基因在小麦中的作用机理奠定了重要基础。     

代谢组研究的生物信息学方法

代谢组是细胞新陈代谢过程中小分子代谢物的集合。新陈代谢为细胞提供生理活动必需的物质和能量。代谢组直接反映细胞的新陈代谢过程,对代谢组的研究体现细胞的功能。细胞功能的异常会导致代谢组的异常,因此通过代谢组数据即可分析出细胞的健康状况。对代谢组物质的提取鉴定过程和代谢组数据的分析方法,主要是对代谢组数据整理和代谢网络推断过程进行综述。     

微藻生物质成分检测方法评述

不断发展的微藻产业需要统一可信的生物质检测方法体系来评估微藻研究、培养及生产中的各种生物质指标。对目前常用的微藻生物质组成的检测方法进行综述及评估,以期推动微藻产业的生物质分析平台标准化。     

进化与未进化小球藻响应苯酚的转录组学分析

苯酚是工业废水中典型的环境污染物。小球藻(Chlorella sp.)由于其生长快、抗逆性强,可以有效利用废水中的酚类化合物,是最有潜力的含酚废水处理藻株。但是高浓度苯酚产生的氧化压力会造成小球藻细胞的氧化损伤。通过实验室适应性进化已经得到了可以耐受500mg/L苯酚的小球藻藻株(L5)。通过无参比较转录组学数据,在基因组尺度上考察了原始小球藻(L3)和进化后小球藻对高浓度苯酚的响应差异。无参比较转录组学结果表明,进化后小球藻能够耐受并降解高浓度苯酚是多个代谢途径整体调控的结果。相比于原始小球藻,进化后小球藻在500mg/L苯酚浓度下对苯酚氧化胁迫的响应增强,主要体现在细胞信号转导、ABC转运蛋白、热休克蛋白、氮代谢和三羧酸循环(TCA)等相关的转录水平明显上调。进化后小球藻通过这些响应降低高浓度苯酚产生的氧化压力。