植物同源盒基因的克隆与功能研究

同源盒基因在植物、动物、菌物的广泛存在说明这种结构在真核生物进化的早期就已出现,并暗示其具有重要功能。本文对植物同源盒基因的克隆与功能研究进行了综述,包括同源盒基因编码蛋白的结构特点、类型,并以玉米Knl、水稻OSH1及拟南芥STM为例,介绍了同源盒基因功能研究的现状。现有证据表明,同源盒基因与植物的发育过程有关。     

用定点诱变技术鉴定蛇毒解联蛋白RGD侧翼氨基酸残基的结构和功能

为了证实蛇毒蛋白RGD侧翼氨基酸残基对ADP诱导的血小板凝聚抑制作用的重要性,分析了RGD环上游氨基酸残基对解联蛋白活性的影响。将位于两种角联蛋白蝮蛇毒素（kistrin）和华丽蛇毒素(elegantin）之间的氨基酸残基和RGD环内的氨基酸残基进行杂交。用定点诱变技术奖elegantin一级结构骨的KKKR^44T^45I^46／A^50RGDN^54P^55分别突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55和 SKAG^44I^46/P^50RGDM^54P^55,这些序列和kistrin中相应的序列S^39RAGT^43/A^50RGDN^54P^55有相似之处,序列由KKKR^44T^45I^46/A^50RGDN^54P^55突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55,显著地降低了elegantin对血小 板凝聚的抑制因子的活性,而T^45的缺人（KKKR^44T^45I^46/A^50RGDN^54P^55突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55）支增强了elegantin对血小板凝聚的抑制作用,进一步研究证明它们的电泳特性是不同的。表明降RGD模体上游39－45倍的氨基酸与RGD侧翼氨基酸残基序列对解联蛋白的结构和功能具有重要作用。     

慈菇蛋白酶抑制剂A和B的活性中心探讨

慈菇蛋白酶抑制A和B（APIA和APIB）是一种双头多功能抑制剂。它们的一级结构和cDNA序列已经被阐明。为了找到它们的活性中心,利用定点诱变的方法将APIB中根据与其他抑制剂家族的序列比较所推断的可能的活性中心残基;Lys^44,Arg^76和Arg87分别用Pro替代,所得到的突变基因分别在酵母分泌体系中得到了表达,与天然的APIB相比,K^44P-APIB对脂蛋白酶的抑制活力没有改变;而R^76P-APIB和R^87P-APIB对胰蛋白酶的抑制活力都分别下降了一半,由原料的抑制两分子变成了一分子,表明Arg^76和Arg^87分别是APIB的两个活性中心残基,而Lys^44则不是,为了证实以上结论,进一步制备了另外3种突变体（K^44P-R^76P-APIB,K^44P-R^87P-APIB,R^76P-R^87P-APIB)。在每个突变体中,3个可能的活性位点中只保留1个,有关的抑制活力测定表明,K^44P-R^76P-APIB(只保留Arg^87)和K^44P-R^87P-APIB(只保留Arg^76)分别只抑制一分子胰蛋白酶,而R^76P-R^87P-APIB(只保留Lys^44)对胰蛋白酶基本不抑制,从而肯定了以上结论,经过测定,两个突变体K^44P-R^87P-APIB对胰蛋白酶的抑制常数Ki分别是0.39nmol/L和0.47nmol/L。突变体R^87L-APIB(APIA中87位是Leu)丧失了接近一半的胰蛋白酶抑制活力,但同时对胰凝乳蛋白酶的抑制活性由原来的基本不抑制变成和APIA相同的可以抑制一分子,证明了Leu^87是APIA的抑制胰凝乳蛋白酶的活性中心位点。     

通过定点诱变法研究耐热碱性磷酸酯酶的活性位点、耐热性和亲热性

通过对耐热碱性磷酸酯酶ＴＡＰＮＤ２７活性位点Ｓ（６９）两侧的Ｅ（６８）和Ｓ（７０）的定点突变,得到了３个突变子Ｅ６８Ｓ、Ｓ７０Ａ和Ｅ６８ＳＳ７０Ａ。在蛋白纯化的基础上测定了３个变体的一些酶学性质,与ＴＡＰＮＤ２７相比,Ｅ６８Ｓ的比活力上升８倍,Ｔｍ下降了３℃,最适反应温度上升了２０℃;Ｓ７０Ａ的比活力上升了１部,Ｔｍ下降了２℃,最适反应温度上升了５℃;Ｅ６８ＳＳ７０Ａ的比活力下降了５０％,Ｔｍ下降     

聚合酶链反应用于高效基因定位改造

聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,简称PCR）是近几年发展起来的一种DNA体外扩增技术,其原理和它的一些应用（诸如在临床医学、考古学和法医学等方面）已有综述[1,2,3].     

解脂耶氏酵母TSR1基因的定点诱变

对解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因进行寡核苷酸介导的定点诱变,限制性内切酶切割的拼接,得到了该基因的一系列缺失突变体。这为进一步研究TSR1基因不同结构域的功能奠定了基础。     

β珠蛋白基因5′远端新沉默子克隆及定点诱变

通过凝胶滞留分析和荧光素酶报告基因检测系统,鉴定出人类β珠蛋白基因５′旁侧远端帽位上游－２１３２～－１８２２ｂｐ间存在一个活性沉默子片段（３１０ｂｐ）,将其亚克隆至ｐＵＣ－Ｔ载体中,然后采用人工设计的突变引物,将经ＤＮＡ足纹分析确定的两个结合位点的核心基序（β珠蛋白基因帽位上游－２０１７～－２０１１ｂｐ间的“ＣＴＴＣＣＧＣ”序列和－２００６～－１９９７ｂｐ间的“ＣＡＣＴＴＴＡＴＴＴ”序列）分别定点诱变为“ＣＴＴＡＡＧＣ”和“ＣＡＣＴＴＡＡＧＴＴ”两个突变序列,从而构建成两种突变型３１０ｂｐ片段,可用于对活性沉默子位点的结构与功能及β珠蛋白基因表达调控机制的深入研究。     

α—淀粉酶成熟蛋白N—端氨基酸序列变化对蛋白分泌的影响

从地衣芽孢杆菌（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）构建的重组质粒ｐＡｍｙ４１３,经过定点诱变,在α－淀粉酶基因的２７１位引入Ｇ取代原来的Ａ,构建成突变型质粒ｐＡｍｙ４１３Ｃ。成熟的α－淀粉酶氨基酸由＋２Ａｓｎ变为＋３Ａｓｐ,其产量是野生型的２．０２－２．５７倍;Ｎ－端氮基酸序列分析发现：信号肽酶Ｉ的切割位点前移了一个氨基酸,即ＡｌａＡｌａ－＋３Ａｓｐ;二级结构分析发现：在自由能为－５１．７ｋｃａｌ时,突变型与野生型的ｍＲＮＡ都形成１４个环状结构,区别在于２７１位的Ｇ不再与２１１位的Ｕ配对,形成Ｇ突出;蛋白质二级结构分析发现：３３－３７氨基酸的转角结构减少了１个氨基酸,这个氦基酸参与形成α－螺旋;这些空间结构和荷电氮基酸的变化有利于蛋白质的分泌。     

信号肽C—端和成熟蛋白N—端氨基酸序列的变化时α—淀粉酶分泌作用的影响

本文利用ｐＡｍｙ４１３质粒通过定点诱变技术,在α－淀粉酶基因的２８７和２９１位分别引入１个Ｇ和Ｃ,代替原来的Ｔ和Ｇ,构建成质粒ｐＡｍｙ４１３Ｂ,使成熟的α－淀粉酶Ｎ－端（７）Ｌｅｕ（８）Ｍｅｔ变为（７）Ａｒｇ（８）Ｉｌｅ。ｐＡｍｙ４１３Ｌα－淀粉酶信号序列因引入１个多酶切点接头而比ｐＡｍｙ４１３的２９个氨基酸增加了１３个氨基酸,创造了１个新的信号肽酶Ｉ识别窗口Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ↓Ｓｅｒ,利用计算机对该信号肽进行了二级结构分析。这两株突变株产酶能力分别为野生株（ｐＡｍｙ４１３）的３％和３６％;胞外α－淀粉酶的分子量同于野生株;末端分析显示,成熟酶第一个氨基酸为Ａｌａ,表明信号肽酶Ｉ在野生型识别窗口Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ↓Ａｌａ处切割。结果还表明,Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶在Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中分泌作用属共翻译转移模型