人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达

目的:构建人神经生长因子信号肽与人β-内啡肽融合基因的真核表达载体,研究人神经生长因子信号肽介导β-内啡肽的分泌表达.方法:取得人基因组后,PCR 法获取人的神经生长因子信号肽部分序列及人β-内啡肽序列;通过 SOE-PCR法将两段 DNA 序列连接,然后插入到真核表达载体内,测序正确后扩增转染级的真核表达载体.表达载体脂质体法转染 NIH3T3细胞,转染后 48-72h 收集细胞及培养上清,RT-PCR 法检测融合基因的转录.RIA 法测定细胞外β-内啡肽的浓度.结果:成功构建全人源的分泌型表达β-内啡肽的真核表达载体,DNA 序列经测序完全符合实验设计;融合基因能够顺利地得到转录并进行表达翻译,在细胞培养上清中可检测到其产物.结论:构建的真核表达载体能够分泌表达人β-内啡肽,提示人神经生长因子信号肽序列能够发挥其介导蛋白产物分泌表达的作用.     

SCID及其基因疗法

SCID是一种罕见的先天性免疫缺陷疾病,以严重的T细胞和B细胞功能缺陷为特征.患者自身不具备免疫系统,只能在完全无菌的条件下生存,因此又称.气泡儿童".基因疗法研究的兴起和深入,给SCID的治疗提供了一条新的途径.该文综述了SCID及其基因疗法的研究进展,并对基因疗法的应用前景进行展望.     

Caspase-3参与调控蟾酥诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的凋亡

采用基因质粒转染技术、荧光发射谱检测分析以及荧光共振能量转移(FRET)受体光漂白技术,首次在活细胞中实时检测中药蟾酥(Chan-Su,CS或bufonis venenum)诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞凋亡过程中caspase-3的活化特性.采用CCK-8(Cell Couneing Kit-8)技术检测发现,蟾酥对细胞的活性具有显著的抑制作用;蟾酥处理稳定表达FRET质粒SCAT3的人肺腺癌细胞后,在不同的时间检测活细胞中SCAT3的荧光光谱;利用共聚焦扫描荧光显微成像技术检测蟾酥处理后细胞的形态,从而进一步证实蟾酥诱导细胞凋亡.实验结果表明:a.蟾酥可以有效抑制人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡.蟾酥对细胞的抑制作用具有剂量依赖性;b.蟾酥处理细胞6 h后能检测到明显的细胞凋亡小体,连续作用24 h后细胞全部皱褶,并有部分细胞破碎;c.蟾酥作用细胞2 h就能明显切割细胞内的SCAT3,细胞内SCAT3的切割程度随着蟾酥作用时间的延长而增加,24 h内细胞内的SCAT3完全被切割.受体光漂白实验也证实了该结论,表明caspase-3参与调控了蟾酥诱导的细胞凋亡过程.     

UTP经PLC-IP3信号通路调控猪冠状动脉平滑肌细胞自发性瞬时外向电流

本文采用全细胞穿孔膜片钳技术研究uTP对急性酶分离的猪冠状动脉平滑肌细胞(coronary artery smooth muscle cells,CASMCs)自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)的作用,探讨细胞内Ca2 释放在UTP产物三磷酸肌醇(inositol 1,4,5.trisphosphate,IP3)调控STOCs过程中的作用机制.结果显示:(1)UTP(40 gmol/L)可明显激活CASMCs的STOCs,使其幅度和频率分别增~0(57.54±5.34)%和(77.46±8.42)%(P<0.01,n=38).(2)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)阻断剂U73122(5 gmol/L)可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.04±7.46)%和(41.65±16.59)%(P<0.05,,n=10);细胞外再加入UTP小能再次激活STOCs(n=7).(3)L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca2 channels,L-VDCCs)阻断剂verapamil(20 gmol/L)和CdCl2(200 gmol/L)几乎不影响UTP对STOCs活性的调节(n=8).(4)1 gmol/L的bisindolylmaleimide I[Bisl,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的特异性阻断剂]可明显激活STOCs,使其幅度和频率分别增加(65.44±24.66)%和(61.35±21.47)%(P<0.01,n=12),细胞外再加入UTP(40 gmol/L)可使STOCs的幅度及频率进一步明显增加(P<0.05,P<0.01,n=12),细胞外继续加入ryanodine(50 gmol/L)则可完全阻断STOCs.(5)UTP(40 gmol/L)预处理细胞后,IP受体(IP3 receptors,IP3Rs)阻断剂2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB,40 gmol/L)可使STOCs的幅度降低(24.08±3.97)%(P<0.05,n=8),对其频率的影响较小(n=8);而80 gmol/L的2-APB则可明显抑制STOCs的活性,使其幅度和频率分别降低(31.43±6.34)%和(40.59±19.01)%(P<0.05,P<0.01,n=6),细胞外继续加入高浓度的ryanodine(50 Bmol/L)可完全抑制STOCs(n=6).用2-APB(40 gmol/L)或ryanodine(50 gmol/L)预处理细胞后,UTP(40 gmol/L)不能再次激活STOCs.以上结果提示:UTP主要通过PLC-IPl信号通路激活急性酶分离的猪CASMCs的STOCs,IP3Rs和ryanodine受体(ryanodine receptors,RyRs)介导的细胞内Ca2 释放在此过程中发挥重要作用.     

蚯蚓体内一组脱氧核糖核酸酶的酶学性质研究

目的：研究一组新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶（earthworm Desoxyribonucleases, EWDs）的主要生化性质。方法：采用SDS-PAGE电泳、MALDI-TOF、酶活性测定等方法。结果：确定了EWD1、EWD2、EWD3(总称为：EWDs)的分子量分别为157.2kDa、69.1kDa和63.5kDa;Km值分别为1.58mg/ml、3.95mg/ml、1.52mg/ml。EWDs在55℃时,酶活性完全丧失。这三种脱氧核糖核酸酶最适pH范围在pH4.0～5.6之间。Mn2＋、Ca2＋是蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD1、EWD2、EWD3的抑制剂,Mg2＋对EWD3有较明显的抑制作用。结论：蚯蚓中的EWDs分子量明显大于DNaseⅠ和DNaseⅡ。对EWDs的温度、pH值、激动剂、抑制剂等影响因素的研究,发现这些参数与已发现的DNases相比较有明显差别。这些提示：蚯蚓组织中发现的脱氧核糖核酸酶EWDs具有特殊的酶学特征,不同于DNaseⅠ和DNaseⅡ,是种新型的脱氧核糖核酸酶,但其作用机理和分类有待于进一步的研究和归类。     

脊髓-硬膜外联合麻醉在肾移植术中的应用

目的:比较联合脊髓-硬膜外麻醉(CSEA)与两点硬膜外麻醉(CEA)方法在肾移植手术中的应用效果.方法:回顾性分析160例肾移植受者临床资料,其中男性109例,女性51例,平均年龄39.2±10.3岁(12-73岁).根据肾移植受者术中采用的麻醉方法将其分为2组:联合脊髓-硬膜外麻醉组(CSEA组,n=80)与两点硬膜外麻醉组(CEA组,n=80).CSEA组患者采用联合脊髓-硬膜外麻醉(L2-3),CEA组采用连续硬膜外两点穿刺法(T12～L1和L3-4).观察两组患者麻醉效果.结果:局麻药用量脊髓-硬膜外麻醉组明显小与硬膜外麻醉组,P＜0.01;血流动力学变化脊髓-硬膜外组给药后15 min MAP明显下降,但不影响移植肾开放后血流灌注.结论:肾移植术脊髓麻醉联合硬膜外麻醉比硬膜外两点穿刺法麻醉起效快、穿刺损伤小、麻药用量少、阻滞平面完全、又能减少不良反应发生.     

人G6PD T279A和T279S两种突变子的体外构建

目的:构建葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose 6-phosphate dehydrogenase,G6PD)T279A和T279S两种突变子.方法:以Genbank No X03674为参考序列设计并合成引物、以含G6PD基因的质粒(Philip JMason博士惠赠)为模板,PCR扩增获得G6PD野生型基因片段,琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物,连接、转化构建克隆质粒pMD18T-G6PD;酶切pMD18T-G6PD质粒、电泳后回收目的基因片段,连接、转化构建含G6PD野生型基因的重组质粒pAL-G6PD;设计并合成含有突变序列的引物,以pAL-G6PD为模板,体外扩增获得G6PD835-海口(835A→G,T279A)和835-中国-1(835 A→T,T279S)突变子.结果:酶切后经电泳鉴定表明获得与预期大小相符的pMD18T-G6PD质粒,EcoRI和Hind Ⅲ双酶切获得与预期大小相符的pAL-G6PD,测序结果与参考序列完全一致.0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,并定量pAL-G6PD单链DNA浓度约为200ng/uL.经测序鉴定并与参考序列比对结果表明获得了G6PD的T279A和T279S两种突变子.结论:成功构建了G6PD的T279A和T279S两种突变子,为下一步原核表达、生化性质以及酶动力学等研究奠定了基础.     

生长抑素受体基因特异性shRNA慢病毒表达质粒的构建

目的:设计并合成生长抑素受体SSTR5基因siRNA序列,并构建其短发夹shRNA慢病毒表达质粒.方法:以小鼠SSTR5基因为靶序列,用在线软件分析、设计并合成其有效siRNA,退火形成双链DNA后,与经BamH I和EcoR I双酶切线性化慢病毒表达载体pSHR-Pμro/GFP连接,产生pLV-shSSTR5重组慢病毒质粒.将重组质粒转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:构建的重组表达质粒PCR产物为161bp,其中插入的SSTR5-siRNA片段为61bp,测序结果与参考序列完全一致.结论:成功构建了小鼠SSTR5基因特异性shRNA慢病毒表达质粒,为进一步采用RNAi技术研究小鼠SSTR5基因表达对其生长情况的影响奠定了基础.     

正常大鼠脑血流动力学的CT灌注成像研究

目的:采用多层螺旋CT灌注成像探讨正常大鼠脑血流动力学特征.方法:对15只健康Wistar大鼠进行CT灌注扫描,定量测定全脑不同区域的血流动力学参数,分析正常Wistar大鼠脑血流动力学特征.结果:正常Wistar大鼠脑部不同区域的血流动力学参数存在较大差异(P＜0.05或0.01),Wistar大鼠的CBF和CBV值以小脑最高,其次是基底节区和延髓,大脑皮质的CBF和CBV值较低:而MTT值在Wistar大鼠脑部各区域比较接近,均值比较无统计学意义(P＞0.05).结论:多层螺旋CT可用于定量评价Wistar大鼠脑组织的血液动力学特征,完全适用于小型动物模型脑部血流动力学的研究.     

正常大鼠脑CT灌注成像的可重复性研究

目的:评价多层螺旋CT灌注成像对正常大鼠脑血流动力学观测结果的可重复性.方法:分别对10只健康Wistar大鼠间隔2d进行CT灌注扫描,两组原始灌注数据由2名放射科医师分别进行5次后处理得出CBF、CBV和MTT值.分析观察者内和观察者间观测结果的可重复性,以及对同一组研究对象间隔2d两次检查结果的一致性.结果:多层螺旋CT对Wistar大鼠脑所采集的灌注原始数据在观察者内和观察者间观测结果均无统计学差别(P＞0.05),并具有很好的线性(CBF和CBV值)或等级(MTT值)正相关(P＜0.01).对同一组研究对象间隔2d的两次CT灌注成像结果也存在同样好的重复性.结论:多层螺旋CT灌注成像对于Wistar大鼠脑部血流动力学观测具有很高的精密度和准确性,完全适于小型动物模型脑部血流动力学的研究.