铜绿假单胞菌表面(氧化)低密度脂蛋白配体的研究

【背景】研究发现铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与(氧化)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL/oxidized low density lipoprotein,ox LDL)具有特异性相互作用,有报道证实P. aeruginosa表达的Rah U蛋白可以与LDL/ox LDL特异性结合。【目的】验证Rah U蛋白是否是P.aeruginosa表面主要的LDL/ox LDL配体。【方法】大肠杆菌表达Rah U蛋白(r Rah U),ELISA验证r Rah U与LDL/ox LDL的相互作用。利用同源重组的方法构建RahU基因缺失突变株(ΔRahU菌株)作为阴性对照菌株,制备小鼠抗r Rah U抗体,经WesternBlot及ELISA分别检测抗r Rah U抗体与P.aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白的结合。通过ELISA方法对P. aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/ox LDL的结合差异进行比较,并对不同蛋白酶水解ΔRahU菌体表面蛋白后ΔRahU菌株与LDL/ox LDL结合能力的差异进行比较。【结果】经ELISA验证rRahU与LDL/oxLDL存在特异性结合。Western Blot及ELISA方法证实小鼠抗rRahU抗体可以与P. aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白特异性结合,而不与ΔRahU菌株相互作用。P.aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/oxLDL结合能力无显著差异,且蛋白酶水解后ΔRahU菌株与LDL/oxLDL的结合能力相近。【结论】RahU蛋白是P. aeruginosa表面的LDL/oxLDL配体之一,但不是唯一的配体。     

N末端亲和标签可增进人硫氧还蛋白-1对氧化剂的敏感性

人细胞质硫氧还蛋白(hTrx1)在抗氧化和氧化还原调控中起重要作用.如果静脉注射重组hTrx1,动物抗氧化能力将增高.近年来,随着人们对氧化还原调控的关注,hTrx1需求不断增加.为了快速获得高纯度重组hTrx1,N末端亲和标签,如组氨酸标签(His-tag)和谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-tag),被用于hTrx1亲和纯化.带N末端标签的hTrx1融合蛋白在实验中用的越来越多.但N末端延长是否会影响hTrx1特性尚不清楚.我们构建与优化了hTrx1原核表达质粒,在大肠杆菌中高效表达了含天然N末端、带His-tag或带GST-tag的3种重组hTrx1.纯化蛋白在SDS-PAGE上呈现1条带,对应的分子量分别为12kD、17kD及38kD.在无氧化剂存在时,它们催化胰岛素还原的能力不分仲伯.当有H2O2存在时,天然N末端hTrx1通过形成可逆二聚体,对H2O2表现出较强的耐受性;而N末端亲和标签有干扰二聚体形成,使hTrx1对H2O2耐受性降低的作用,其中GST-tag干扰作用明显大于His-tag.此外,体内重要的氧化还原对GSH/GSSG,有增进hTrx1及其还原酶催化NADPH氧化的作用,N末端亲和标签可明显扩大GSH/GSSG的这种作用.我们分析了N末端亲和标签对hTrx1活性影响的可能机理.     

三种淋巴瘤细胞CD52抗原呈现稳定性研究及其应用

评估淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现稳定性,并比较三种细胞用于抗CD52单抗活性检测中的优劣性。采用免疫荧光法检测淋巴瘤细胞MC/CAR、HUT78和RAMOS的CD52抗原呈现率,分析MC/CAR、HUT78和RAMOS传代培养5~20代CD52抗原呈现稳定性。分别以MC/CAR、HUT78和RAMOS作为抗CD52单抗结合活性和补体依赖细胞毒性的靶细胞进行检测,并比较其优劣性。结果显示,MC/CAR、RAMOS和HUT78的CD52抗原呈现率分别为95.5%、63.2%和38.3%。MC/CAR传代培养5~20代CD52抗原呈现率均大于90%。RAMOS传代培养5~13代CD52抗原呈现率介于60%~67%,第14~15代CD52抗原呈现率介于50%~60%,第16~20代细胞CD52抗原呈现率介于40%~50%。HUT78传代培养5~20代CD52抗原呈现率介于26.7%~38.9%。淋巴瘤细胞MC/CAR在抗CD52单抗的结合活性检测中呈现出更好的剂量依赖曲线。淋巴瘤细胞RAMOS在抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测中呈现出更好的剂量效应曲线。CD52抗原呈现率方面MC/CAR>RAMOS>HUT78。结果表明,MC/CAR更适用于抗CD52单抗的结合活性的检测,RAMOS适用于抗CD52单抗的补体依赖细胞毒性检测。     

HCMV大小鼠眼组织损伤模型的初步研究

目的探讨接种人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)是否引起Wistar大鼠、昆明种小鼠眼组织损伤.方法将HCMVAD169毒株经静脉接种Wistar大鼠和昆明种小鼠,观察动物眼部发病情况,原位杂交检测动物眼组织中的HCMVDNA片段.结果接种病毒后部分动物缓慢出现眼部发病,局部分泌物增多、浑浊甚至失明;经原位杂交于视锥、视杆细胞和角膜内皮细胞中检出HCMVDNA片段.结论HCMV可以感染动物眼组织,并引起动物发生眼病.     

新生BALB/c小鼠肠道潘氏细胞的分布规律

观察BALB/c小鼠小肠潘氏细胞的分布规律。应用石蜡切片、H&E染色技术和LeicaQwin显微图像处理系统,分别对2 d、4 d、6 d、8 d、10 d BALB/c小鼠小肠内潘氏细胞的形态发育、分布规律进行观察和分析。结果发现,4日龄前的BALB/c小鼠各段小肠中肠腺发育尚不完整,未见有潘氏细胞。6日龄后,潘氏细胞开始出现,数量随日龄增加呈递增趋势增长,各日龄间差异显著(P<0.05)。BALB/c小鼠肠道潘氏细胞存在于小肠,十二指肠和空肠较少,回肠较多,各组(不同日龄/肠段)之间差异显著(P<0.05)。     

Ro52蛋白的分子生物学研究进展

Ro52蛋白作为靶抗原,存在于多种自身免疫性疾病,如干燥综合征、系统性红斑狼疮、皮肌炎等患者的血清中。Ro52蛋白是TRIM蛋白家族成员(TRIM21),其分子内含有RING-finger、B-box、卷曲螺旋结构域,分别具有不同的生物学功能。Ro52蛋白在免疫防御中的作用日渐为研究者所关注,如Ro52与IgG分子的作用、Ro52作为一种E3泛素连接酶与其他信号分子的作用等。其自身泛素化和广泛的泛素化作用已经在Ro52与干扰素的作用中得到了体现。迄今,Ro52在自身免疫性疾病中的具体致病机制还不清楚。我们尝试通过介绍Ro52的分子生物学特点及其与相关活性分子的相互作用的最新研究进展,初步探索其可能的致病机制。     

轮状病毒致乳鼠肠道外感染Th1/Th2细胞因子变化的研究

目的通过复制轮状病毒（RV）肠道外感染乳鼠的动物模型,检测接种后乳鼠体内Th1/Th2平衡改变,对RV肠道外感染后机体免疫状态进行初步研究。方法48只乳鼠随机均分为3组：肠道外组、肠道内组和正常对照组。肠道外组通过腹腔注射猴RVSA11株,肠道内组灌胃等量RV悬液,对照组无特殊处理。分别在接种后第4天、第8天处死乳鼠,收集标本,观察心、肝、肾、肺等脏器病理变化,用ELISA法检测血清中IL-10和IFN-γ的表达。结果光镜下肠道外组乳鼠肾、肝、肺和脾脏出现病理改变。感染后第4天,肠道内、外组乳鼠血清IFN-γ水平均高于正常组,到第8天明显下降,基本达到基线水平;IL-10在肠道外组第4天增高,到第8天小幅下降,但仍然高于正常组;而肠道内组IL-10无明显改变。结论RV肠道外感染早期呈现Th1-Th2混合反应,而后期则以IL-10的表达为主,T细胞向Th2型免疫应答方向偏离,Th1/Th2细胞因子失衡机制可能是RV肠道外感染的重要因素。     

灵长类动物基因编辑技术研究进展

灵长类动物因与人类在遗传、生理和神经功能上的高度相似性而使其在生物医学研究领域中占有非常重要的地位。构建人类疾病的灵长类动物模型,是研究疾病发病机理和探索潜在治疗手段的重要途径,而通过基因编辑的方法获得灵长类动物模型是研究一些遗传性疾病最可靠的方法。灵长类动物基因编辑技术先后经历了传统的转基因和精准基因打靶两个时代。对近年来灵长类动物基因编辑研究进行综述,重点介绍最新的利用核酸酶技术进行精准基因编辑的研究进展。     

变色酸显色法同时测定核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性

提出一个用变色酸-硫酸显色浊同时测定核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)羧化酶/加氧酶活性的方法:RuBP羧化酶/加氧酶与底物作用后,用碱性磷酸酯酶将其产物水解生成乙醇酸和甘油酸,然后与变色酸试剂在1:5的体积比下,沸水浴中显色反应90min,乙醇酸与变色酸反应生成红紫色化合物,甘油酸生成淡棕色化合物,分别在573nm,745nm各有一特征吸收峰。根据A_(573),A_(745)与乙醇酸和甘油酸浓度间的函数关系式,求出RuBP羧化酶/加氧酶活性。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。