苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

【目的】丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%~92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。     

国内外苜蓿育种中的分子标记技术

概述了分子标记技术在苜蓿系统发育、种质资源、遗传育种以及根瘤菌的特异性等方面的国内外研究进展,简述了几种分子标记技术在苜蓿各研究领域的作用和贡献,并展望了分子标记技术在中国苜蓿研究中的广泛应用前景。     

离子注入介导麻黄和甘草总DNA转化苜蓿的初步研究

目的:探索离子注入介导麻黄和甘草总DNA转化苜蓿的方法与效果。方法:氩离子(Ar )注入介导麻黄和甘草总DNA在2个品种的苜蓿中转化,对种子发育正常的T1代苜蓿单株进行生物碱类、黄酮类和皂苷类物质进行定性检识。结果:苜蓿种子经离子注入介导转基因处理后,T1代结荚率很低,复合DNA处理的183和283的结荚率分别为6.40%和8.33%,正常发育的种子分别为2.40%和5.83%。获得了种子发育良好的苜蓿T1代单株50株,其中6个单株根或茎的天然产物定性检识呈阳性。结论:Ar 注入介导外源DNA大分子的转化对苜蓿种子的发育具有很大影响,获得的转基因苜蓿T1代种子,为进一步开展相关化学证据和分子证据的研究提供了宝贵的材料。     

苜蓿人工草地节肢动物群落的时间格局

调查了甘肃省庄浪县苜蓿人工草地节肢动物群落的组成及多样性变化,应用主分量分析和最优分割法对节肢动物群落的时间格局进行了研究。结果表明,苜蓿人工草地节肢动物群落的物种丰富度,多样性和均匀度指标在时间过程中的变化有明显的差异和规律性,6月下旬害虫和天敌的物种丰富度均达到最大值,但天敌的个体数量高峰明显落后于害虫,在时间变化过程中,影响节肢动物群落的主导因素和时间格局分化明显,根据研究结果,将苜蓿人工草地节肢动物群落在时间动态中的变化划分为5月上旬以前,5月中旬-6月上旬,6月中旬-7月中旬,7月中旬以后4个阶段,并结合气候,物候变化,分析了各阶段内主要害虫和天敌的发生特点,提出了害虫的治理对策。     

苜蓿叶片水杨酸含量与其蓟马抗性的关系

采用不同抗蓟马特性的苜蓿品系,于不同蓟马虫口密度下测定苜蓿水杨酸含量和虫害程度,以明确苜蓿叶片水杨酸含量与其抗蓟马特性的关系.结果表明,苜蓿叶片游离态、结合态水杨酸含量均与苜蓿抗蓟马特性密切相关;高抗品系(抗蓟马品系)的水杨酸初始含量(0.539 mg·g-1)高于低抗品系(0.403 mg·g-1);与较低抗品系相比,高抗品系受害器官(叶)水杨酸含量随虫口密度和危害点面积的增大而增加相对缓慢,而随危害指数的增大而增加较快(3.84倍).可见,水杨酸主要是间接增强苜蓿对蓟马的抗性;高抗蓟马苜蓿品系能通过快速获得较高水杨酸含量来阻碍被危害伤口的扩大,降低其受危害程度,促使自身产量和品质提高.     

抗、 感蓟马苜蓿无性系对蓟马危害的补偿光合生理反应比较

为了揭示苜蓿的补偿生长相关的光合生理补偿机制, 以大田单株筛选、 扦插扩繁的抗蓟马苜蓿无性系R-1和感蓟马苜蓿无性系I-1为材料, 以相邻老苜蓿田自然发生的蓟马作为虫源, 任其持续危害, 于现蕾期和初花期通过模拟有效光辐射和固定CO₂浓度, 测定R-1和I-1的光合特性和水分利用特性。结果表明： (1) 在现蕾期, R-1受害后叶片叶绿素含量显著增加, 净光合速率 (net photosynthetic rate, Pn) 显著增大, 光补偿点 (light compensation point, Lcp) 和暗呼吸速率 (dark respiration rate, Rd) 均显著降低 (P<0.05) ; 而I-1叶片叶绿素含量显著降低 (P<0.05) , 植株净光合速率 (Pn) 与对照差异不显著 (P＞0.05) , 且在低于正常光照强度时, 受害I-1植株Pn相对健株下降, 同时, 其光补偿点 (Lcp) 和暗呼吸速率 (Rd) 均显著升高 (P<0.05) ; R 1和I 1受害后植株胞间CO2浓度 (intercellular CO2 concentration, Ci) 、 蒸腾速率 (transpiration rate, Tr) 和气孔导度 (stomatal conductance, Gs) 均显著升高 (P<0.05) , 水分利用效率 (water use efficiency, WUE) 均显著降低。 (2) 在初花期, 在较强的光照条件下, 受害I-1植株Pn显著增大 (P<0.05) ; 在弱光下受害R-1植株Pn增大, 而受害I-1植株Pn显著降低 (P<0.05) , 其他指标变化同现蕾期。结果说明, 抗蓟马无性系R-1对蓟马的危害具有显著的补偿光合作用; 而感蓟马无性系的补偿光合作用滞后于初花期发生, 且需要较高的光强条件, 这种滞后发生的补偿光合作用对于苜蓿产量的补偿贡献意义不大。     

苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)nodD3P1启动子下游序列的缺失和互补分析

在苜蓿根瘤菌中,nodD3基因的转录由两个彼此分离的启动子P1和P2控制. 在P1下游是一段由660 bp组成的序列, 接着是nodD3的编码区. 由P1下游序列3′末端开始缺失得到的一系列缺失突变体的遗传分析指出, P1下游＋1~＋125 nt序列对P1的表达是必须的. 互补分析和结瘤试验指出, ORF2自我抑制P1的表达, 而＋1~＋125 nt序列可对抗ORF2对P1的抑制作用.     

蚜虱净对苜蓿主要害虫及天敌种群数量的影响

在甘肃省定西市九华沟系统研究了喷施蚜虱净对苜蓿主要害虫及天敌种群数量动态的影响。结果表明,施药田蚜虫和蓟马的季节平均数量极显著高于对照田,而盲蝽和瓢虫、小花蝽、蜘蛛等大多数天敌的季节平均数量则极显著低于对照田,寄生蜂与对照田没有湿著差异。喷施蚜虱净对种群数量时序动态的影响在不同害虫和天敌种类中表现不同,5月底施药后7d对照田蚜虫和蓟马的种群数量分别为施药田的4．13倍和5．2倍,此后施药田害虫的种群数量开始迅速增加,到6月底2种害虫的种群数量均与对照田无显著差异,到7月中旬以后反而显著高于对照田。施药对盲蝽种群数量时序动态的影响与蚜虫和蓟马不同,5月底施药后盲蝽的种群数量一直显著低于对照田,直到7月下旬以后,种群数量才恢复到对照田的水平。喷施蚜虱净对天敌种群数量的时序动态有极显著的影响,大多数天敌的种群数量在5月底施药后到7月底都一直显著低于对照田,直到8月上旬才恢复到对照田的水平。施用杀虫剂在防治害虫的同时杀伤大量天敌,使害虫的种群数量迅速增加,甚至造成更严重的为害。因此在菖蓿上使用对天敌杀伤力小的杀虫剂对保持天敌的自然控制能力有重要作用。     

苜蓿中华根瘤菌代谢组学样品制备方法的研究

代谢组样品制备是代谢组学研究的基础。本文以维生素B12生产菌株苜蓿中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti 320为研究对象,通过检测细胞损伤、ATP泄漏、代谢物回收效率以及细胞代谢淬灭效率综合评价细胞淬灭方法,同时对5种提取试剂的提取效率进行比较优化胞内代谢物的提取方法。最终获得苜蓿中华根瘤菌S.meliloti 320的胞内代谢组学样品制备较佳条件:即-20℃40%甲醇淬灭细胞,过滤收集淬灭细胞,甲醇/乙腈/水(体积比为2∶2∶2,外加0.1%的甲酸)与50%甲醇相结合提取胞内代谢物。实验结果显示-20℃的40%甲醇(通过过滤收集细胞)对细胞膜的损伤较小,且细胞代谢淬灭效率和回收效率较高;甲醇/乙腈/水(体积比为2∶2∶2,外加0.1%的甲酸)与50%的甲醇对胞内代谢物的提取效率较高且有互补作用。     

旱作条件下不同苜蓿品种光合作用的日变化

晴天,利用LI-6400光合仪研究了旱作条件下4年生紫花苜蓿新疆大叶、巨人201、牧歌401和路宝再生草初花期（2004年6月23日）的光合作用日变化特征.结果表明：①4个苜蓿品种Pn、Tr和Gs的日变化曲线均呈“双峰”型,12：00左右存在明显的光合＂午休＂现象,但不同品种Pn、Tr和Gs的高峰和低谷出现的时刻和高低不同.WUE日进程,除路宝呈“单峰”型外,新疆大叶、巨人201和牧歌401呈“双峰”型,4个品种在8：00左右的WUE均达到全天的最高值,14：00左右的峰值不明显.②根据Pn、Ci、Ls的变化方向,推测4个品种的光合“午休”主要受气孔因素限制.③国外苜蓿品种巨人201、牧歌401和路宝日平均Pn、Tr和WUE均优于国内地方品种新疆大叶,尤其是巨人201是一种高光合、高蒸腾、高水分利用率的品种.④相关分析结果表明,对Pn影响最显著的因子是PAR,其次是Gs、RH、Ta和VPD;对蒸腾速率影响最显著的因子为PAR,其次是RH、Ta、Gs和VPD.