构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与P_acoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl₂·4H₂O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达P_cdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝P_AE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。     

玫瑰色微球菌A-04的红色素鉴定及稳定性分析

从石油污染的土壤和水样中筛选出一株玫瑰色微球菌A-04 Micrococcus roseus,对其所产红色色素进行了分离,并初步鉴定了色素种类,基于对影响A-04色素稳定性的单因素分析基础之上,采用3因素3水平响应面分析法,进一步对影响色素稳定性的主要因素进行了优化分析。结果表明A-04所产红色色素为类胡萝卜素,对该菌株的色素稳定性的单因素条件分析,色素对环境条件的耐受性较好,在80℃、pH5. 0～8. 0等条件下依然能长时间保持鲜红而不褪色。经响应面优化分析表明:温度、pH和溶剂是影响该色素稳定性的主要因素,温度与溶剂的交互作用对色素稳定性的影响也较为明显。pH5. 0～8. 0之间时,在80℃范围内,温度越低,同时溶剂的极性越大,越有利于维持色素的稳定性。本研究结果为该色素的实际开发和应用奠定了基础。     

CRISPR/Cas9在放线菌合成生物学研究中的应用和发展

放线菌是活性天然产物和抗生素药物的重要来源。利用合成生物学高效地开发其中丰富的天然产物资源,将为加速新药开发奠定坚实的基础。CRISPR/Cas9作为一种多功能基因编辑系统,因其便捷高效而被广泛应用于真核生物的遗传操作。但在原核生物尤其是放线菌中的应用仍处于起步阶段,机遇和挑战并存。本综述总结了目前CRISPR/Cas9系统在放线菌基因编辑和调控,以及活性天然产物的产量提升、生物合成机制解析和资源开发等方面的研究进展。同时,也对该系统在应用中面临的包括重组修复效率低,以及靶向切割效率不足等关键挑战进行了分析,并提出了相应的优化解决方法。随着CRISPR/Cas9在放线菌应用中的不断完善和发展,将极大地推动放线菌的合成生物学研究,促进其中天然产物资源的有效挖掘和应用开发。     

陇东黄土高原丘陵沟壑区天然草地植物多样性研究

以陇东黄土高原丘陵沟壑区天然草地30个植被样点的样方资料为依据,以相对生物量为指标,对该地区群落植物多样性进行了研究。结果表明,该地区天然草地可划分为长芒草草原、次生杂类草草原和杂类草草甸草原3个植被类型,16个群落按放牧程度分为禁牧草地、轻牧草地和过牧草地3个层次。多样性指数显示草甸草原>长芒草草原>次生杂类草草原,轻牧草地>禁牧草地>过牧草地的趋势。放牧程度可能是影响该区域天然草地植物多样性的关键因素,出现海拔增高和降水增加多样性指数降低的趋势可能是放牧干扰的结果。相关性分析显示物种的Shannon-wiener和Simpson多样性指数与Shannon和Simpson均匀度指数间均呈显著正相关,而与生物量之间呈显著负相关。     

CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。     

近几十年来冀西北山地白桦次生林径向生长对气候变化的响应

研究不同海拔高度天然次生林径向生长特征及其对气候变化的响应, 揭示影响山地树木径向生长的主要因子, 对于研究气候变化对温带森林生态系统适应性生长、演替和可持续经营的影响具有重要意义。该研究以冀西北山地次生林优势树种白桦(Betula platyphylla)为对象, 于研究区海拔1 350、1 550、1 750、1 950 m处分别设置样地, 采集样木树芯和圆盘, 运用树木年轮气候学方法建立白桦天然次生林标准年表, 并将年轮宽度指数与气候因子进行相关、多元逐步回归分析。主要结果: (1) 1960-2018年研究区气候呈变暖变干趋势, 其中1960-1989年为平稳期, 1989-2018年为快速期。(2)白桦次生林径向生长在1989年发生改变, 年轮宽度指数呈现“增长-下降”的“Λ”形生长趋势。(3)在气候变化平稳期, 白桦次生林径向生长在低海拔样地(B1350、B1550)与气温(平均气温、最高气温、最低气温)呈正相关关系, 在高海拔样地(B1750、B1950)与上年和当年生长季降水量呈显著正相关关系; 在气候变化快速期, 低海拔样地(B1350、B1550)白桦次生林径向生长与生长季气温、生长季潜在蒸散发(ET₀)呈负相关关系, 高海拔样地(B1750、B1950)白桦次生林径向生长与生长季及生长季末期ET₀呈负相关关系。 (4)在气候变化平稳期, 温度对B1350、B1550、B1750样地白桦次生林径向生长的贡献率分别为76%、54%、51%, 水分的贡献率为24%、46%、49%; 在气候变化快速期, 温度对B1350、B1550、B1750样地树木径向生长的贡献率分别为58%、41%、38%, 水分的贡献率为42%、59%、62%; 高海拔B1950样地树木生长始终受水分因子的控制。     

基于同义密码子使用的原核生物基因组大、小染色体及质粒进化特征分析北大核心CSCD

基于同义密码子偏好分析,对54个原核基因组大、小染色体及质粒中蛋白质编码基因的序列特征进行了对比分析。结果表明,大、小染色体中蛋白质编码基因的GC含量分布相近,质粒中蛋白质编码基因的GC含量分布与所在物种全基因组的GC含量差别较大。进一步的分析表明,大、小染色体共同偏好的密码子最多,且具有相近的起始密码子和终止密码子使用特征。基于对应分析的同义密码子使用模式分析表明,大、小染色体具有相近的序列特征,且大、小染色体及质粒之间具有不尽相同的影响因素。这些结果可为今后原核生物基因组进化研究提供可靠的方法和理论依据。     

不完全酶切去除载体多个相同酶切位点的简易方法

以去除真核表达载体pIGF3的3个EcoR Ⅰ位点为例,介绍一种通过不完全酶切去除载体多个相同酶切位点的方法。本方法步骤简单,经济实用。     

碳离子束辐照对质粒DNA的损伤效应

为了证明DNA双链断裂(DSB)片段分布与DNA序列有关的假设,采用32keV／μm的^12C^6 离子和45ke V／μm的^13C^6 离子分别辐照pUCl8质粒,结合限制性内切酶处理,进行琼脂糖凝胶电泳,分析DNA断裂和片段分布。结果表明,除了由一个DSB导致的线性DNA带外,还出现了一条新的、小分子量线性DNA带;限制性内切酶处理后,有另一条线性DNA带产生。证明重离子辐照诱导的DSB是非随机分布的,DNA分子上存在对电离辐射相对敏感的位点。     

遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化

将两株具有不同遗传标记的枯草芽孢杆菌在基本培养基中分别培养至对数生长后期后进行短时间混合静置培养 ,经选择平板筛选、DNaseI敏感性试验、质粒检测和产蛋白酶活性检测 ,发现两菌株之间可通过自然遗传转化进行染色体DNA和质粒DNA的交换。研究结果表明 ,自然遗传转化可在细胞间进行 ,这对揭示微生物群居的自然环境中可能存在的细胞间的DNA转移 ,以及正确评估遗传工程微生物(GEMs)的安全使用具有重要意义。