白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。     

L-天冬氨酸-α-脱羧酶高产菌株初筛方法的建立

通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。     

针对T315I 突变的Bcr-Abl 酪氨酸激酶抑制剂研究进展

BCR-ABL 是一种由bcr 基因和c-abl 原癌基因融合产生的致癌基因。该基因表达的Bcr–Abl 癌蛋白是慢性粒细胞白血病的病理学基础。因此研发选择性的Bcr–Abl 酪氨酸激酶抑制剂成为治疗慢性粒细胞白血病的一种有效策略。目前已有数个Bcr–Abl 酪氨酸激酶抑制剂获准上市。然而,Abl 激酶结构域的突变或其他原因导致肿瘤耐药性的出现,其中T315I 突变是最重要的突变之一,引发的耐药性更是难以克服。重点介绍了针对T315I 突变的Bcr–Abl 酪氨酸激酶抑制剂的研究进展。     

细菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的分子机制及分子改造研究进展

L-天冬氨酸α-脱羧酶能够催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸,是泛酸代谢中的关键酶之一,对生物体中的能量代谢和脂肪代谢至关重要。细菌L-天冬氨酸α-脱羧酶属于丙酮酰依赖型的一类酶,具有特别的翻译后加工机制和底物失活作用,本文对L-天冬氨酸α-脱羧酶的分子机制和分子改造进行了综述,并对其在β-丙氨酸合成方面的应用进行了展望。     

人NMDA受体主亚基M3-M4环基因片段的高效表达、纯化与鉴定

用基因工程方法获得人N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate ,NMDA)受体主亚基M3 M4环靶片段 ,以此为免疫原 ,用于进一步免疫原性及相关应用研究 .自人脑胶质瘤组织中提取总RNA ,采用RT PCR扩增出人NMDA受体主亚基M3 M4环的基因片段 ,并按照计算机辅助原核表达载体pBV2 2 0中外源基因高效表达的数学模型预测方法 ,将其进行优化改构 .将目的基因克隆到pBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,升温诱导表达 ,从蛋白质水平检测重组体在大肠杆菌中的表达情况 ,通过制备性SDS PAGE进行纯化 ,从相对分子质量、免疫反应性、肽质谱指纹分析等方面进行鉴定 .结果表明 ,成功构建了人NMDA受体主亚基M3 M4环的原核表达载体 (命名为pBV NR1L3) ,通过基因优化 ,实现了高效表达 .凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白 2 9% ,重组肽纯度达 95 %以上     

肝细胞生长因子对四氯化碳损伤原代培养大鼠肝细胞的保护作用

本工作采用无血清原代培养大鼠肝细胞法,观察了重组人肝细胞生长因子（ｒ－ｈＨＧＦ）对四氯化碳（ＣＣｌ４）致大鼠肝细胞损伤的保护作用。结果表明,ｒ－ｈＨＧＦ对ＣＣｌ４染毒肝细胞有明显的保护作用。ｒ－ｈＨＧＦ保护组较ＣＣｌ４染毒组细胞存活率显著升高,细胞内丙氨酸转氨酶、钾离子漏出明显降低。结果提示,ｒ－ｈＨＧＦ可减轻ＣＣｌ４对肝细胞膜的损伤,提高细胞膜的结构完整性     

肌萎缩侧索硬化脊髓器官型培养模型的建立

利用谷氨酸转运体抑制剂苏—羟天冬氨酸(THA)制备选择性运动神经元凋亡的肌萎缩侧索硬化(ALs)脊髓器官型培养模型。取出生后8天乳鼠腰段脊髓组织切成脊髓薄片,在培养液中分别加入不同浓度THA,用SMI—32免疫组化染色对脊髓腹角α运动神经元进行鉴定,calretinin免疫组化染色对背角中间神经元进行鉴定,测定培养液中谷氨酸(Glu)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量,并与对照组比较。结果显示对照组α运动神经元数目恒定;THA引起培养液中剂量依赖性Glu、LDH含量增高和SMI—32阳性的α运动神经元数目减少,脊髓背角的中间神经元损伤相对较轻;100μmol／L THA组在体外培养4周后,细胞外Glu含量增高,SMI—32阳性的α运动神经元数目较对照组明显减少,背角的中间神经元数目无显著变化,可以制成ALS脊髓器官型培养模型。     

半理性设计进化土曲霉来源的ω-转氨酶AtTA热稳定性

转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景。但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了ω-TA的应用。为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q (M3)。与At TA野生酶(wild-type, WT)相比,M3的半衰期t_1/2 (35℃)由17.8 min提升至102.7 min,提升了4.8倍,半失活温度T₅₀¹⁰比WT (38.1℃)提高2.2℃。最佳突变酶M3对丙酮酸和1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的1.59倍和1.56倍。分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨...     

浅低温对失血性休克早期血清乳酸及肝功能的影响

目的研究人工诱导浅低温对创伤性失血性休克兔早期复苏的影响。方法将SPF级健康新西兰大白兔20只,随机分为2组,浅低温组和常温组,每组10只。予乌拉坦麻醉后,采用肾动脉放血法并行小肠夹伤,建立出血未控制失血性休克兔模型。止血前分别将两组实验动物肛温控制在常温(38℃)或浅低温(34℃),顺序予以限制性液体复苏、止血、常压液体复苏并观察8h。期间在基础点(BL),休克起始点(T0),T120(T1),T240(T2),T360(T3),T480(T4)共6个时间点检测血清乳酸(LACT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度,以及终点时存活数、总输液量,并进行分析比较。结果 (1)实验终点时,浅低温复苏组存活兔(9/10只,生存时间477min)较常温复苏组(8/10只,生存时间461min)稍高,但无统计学意义(P0.05);(2)浅低温组T1~T4各时间点的血清乳酸ALT、AST均低于常温组(P0.05)。结论创伤性失血性休克早期应用浅低温治疗有利于抑制酸中毒进展及保护肝脏功能,其机制可能与低温能减轻休克导致的缺血再灌注损伤所引起的损害有关。     

yapsin蛋白酶家族研究进展

yapsin蛋白酶是一类糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的天冬氨酸蛋白酶,能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点,起着加工前肽的作用。近年来研究发现,工程菌表达某些外源蛋白时发生的降解现象与yapsin蛋白酶有紧密的关系。概述了yapsin蛋白酶家族的命名、结构、定位、酶原激活、基因表达及底物特异性和功能。