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991.
10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)是蜂王浆中的主要脂肪酸成分,具有抗菌、抗癌、延缓衰老等多种生理活性,但目前关于10-HDA生物合成的分子机制还不清楚。通过克隆蜜蜂NADPH-细胞色素P450还原酶(EC 1.6.2.4,NADPH-cytochrome P450 reductase,CPR),在大肠杆菌中异源表达,并对其酶学特性进行分析。结果表明重组菌经IPTG诱导后表达蛋白的分子量与预期一致,为86.29 kDa,Ni-NTA亲和纯化后测得其比活性为77.33(EU of CPR)/μg。酶学性质分析结果表明蜜蜂CPR酶最适温度与pH分别为40℃和8.0,并对一些金属离子及有机溶剂具有不同程度的耐受性。其对底物细胞色素C的动力学参数Km和kcat分别为76 μM和268/min。以上研究为探究CPR在10-HDA生物合成途径中的功能奠定理论基础。 相似文献
992.
【目的】探讨酚氧化酶(phenoloxidase, PO)在德国小蠊Blattella germanica对大肠杆菌Escherichia coli的免疫响应中的作用。【方法】利用同源克隆和RACE方法获得德国小蠊酚氧化酶基因(BgPO)的全长cDNA序列,用MEGA5.1软件构建BgPO与其他昆虫PO的系统进化树,用RT-PCR方法检测BgPO的组织表达模式及大肠杆菌诱导后不同时间的表达量变化,用Hultmark 方法测定抑菌活力,用邻苯二酚法测定酚氧化酶活性。【结果】获得的德国小蠊BgPO基因(GenBank登录号:KJ789157)cDNA全长为2 252 bp,其中开放阅读框大小为2 085 bp,编码695个氨基酸,预测的分子量和等电点分别为79.7 kDa和6.19。Blast分析结果表明德国小蠊BgPO与其他昆虫PO有较高的同源性,其中与白蚁Coptotermes formosanus PO的氨基酸序列一致性高达80%;系统进化树分析显示其与C. formosanus PO的亲缘关系最近。基因表达检测结果表明BgPO主要在血淋巴细胞和表皮中表达。大肠杆菌诱导德国小蠊后,发现BgPO的表达量在诱导24 h后升高,在诱导后36 h达到峰值;其血淋巴的抑菌活力及酚氧化酶的活性在诱导后6-36 h内均随着诱导时间的增加而增加,且菌诱导组与PBS诱导组之间存在显著差异(P<0.05)。【结论】本研究获得的德国小蠊酚氧化酶基因BgPO主要在血淋巴和表皮中表达,并参与了大肠杆菌诱导的免疫应答反应。研究结果为进一步探索酚氧化酶在德国小蠊对病原菌的免疫响应机制奠定基础。 相似文献
993.
994.
995.
996.
原核系统可溶性表达策略 总被引:10,自引:0,他引:10
获得大量目的蛋白的最简单最经济的方法是利用原核表达系统表达外源基因.但由于原核系统的自身特点,使所表达的蛋白常常形成无活性的包涵体.多年来世界各国的研究为解决这一问题尝试了多种方法.本简单介绍原核表达系统的特点及提高蛋白可溶性表达的常用方法. 相似文献
997.
以葡萄糖为唯一碳源合成聚-4-羟基丁酸的重组大肠杆菌的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
为实现重组大肠杆菌以葡萄糖为唯一碳源合成均聚的P( 4HB) ,PCR扩增大肠杆菌编码谷氨酸:琥珀酰半缩醛转氨基酶基因(gabT) ,谷氨酸脱羧酶基因(gadA)以及富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16的4_羟基丁酸脱氢酶基因(gadB) ,并组装到携带富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)H16的PHA聚合酶基因(phaC)和克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)中编码4_羟基丁酸:CoA转移酶基因(orfZ)的重组质粒pKESS5 3上,形成一个大的操纵元。携带重组质粒的大肠杆菌获得从三羧酸循环的中间物———α_酮戊二酸到P( 4HB)的代谢途径。结果表明,重组大肠杆菌可以以葡萄糖为唯一碳源合成均聚的P( 4HB) ,当向以葡萄糖为唯一碳源的无机培养基添加蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物时,P( 4HB)的含量可以高达菌体干重的30 %。 相似文献
998.
通过对大肠杆菌生长温度、膜脂肪酸组成和压力抗性之间关系研究发现,10℃培养,对数期细胞有最大的压力抗性,随着培养温度的升高直到4 5℃,压力抗性呈下降的趋势;相反,10℃培养,稳定期的细胞对压力最敏感,随着培养温度的升高,压力抗性呈增加趋势,30~37℃时达到最大,之后到4 5℃有下降。对数期和稳定期细胞膜脂中不饱和脂肪酸的组成随温度的上升而下降,这与从全细胞中抽提的磷脂的熔点密切相关。因此,对数期细胞压力抗性随着膜流动性的增大而升高;但稳定期细胞,膜流动性与压力抗性之间不存在简单的对应变化关系 相似文献
999.
根据GenBank中毒素基因vt1、vt2序列设计合成4对引物,以大肠杆菌O157菌株DNA为模板,扩增vt1、vt2,从只含有vt2的菌株中诱导释放噬菌体,以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增,获得vt2、vt2-A、vt2-B3条特异性DNA带;将vt2-A、vt2-B扩增产物纯化后,分别插入pMD18-T载体,测序结果与相应序列比较,vt2-A和vt2-B亚单位的基因序列与GenBank中编码VT2毒素的A、B亚单位的核苷酸序列(X07865,NC_002655,:BA000007,AF291819)的同源性分别为98%~99%、96%~100%,确定vt2位于噬菌体,并为进一步研究大肠杆菌O157中VT噬菌体的毒力转导、VT2毒素的表达和应用奠定基础。 相似文献
1000.
试验目的是获得S蛋白受体结合域基因,并获得其高效表达,为SARS病毒受体的进一步研究奠定一定的基础。首先通过P(取方法获得了S蛋白起始密码和SalⅠ限制性内切酶之间包含受体结合区的片段,然后将该基因定向克隆到pET-22b原核表达载体,构建了per—22b—S1重组质粒,转化大肠杆菌并诱导目的蛋白的表达,经SDS—PAGE没有发现明显的目的蛋白带。利用载体和S1基因上的NeoⅠ酶切位点,将S1基因的信号肽序列和部分疏水序列切掉后,构建pET—22b—SNS重组质粒。pET—22b—SNS重组质粒仍然包含受体结合域序列,并且阅读框没有改变。将pET—22b—SNS转化大肠杆菌,发现明显的目的蛋白带。Westem blot结果表明表达蛋白为SARS病毒S1蛋白的一部分。 相似文献