黑曲霉外源表达系统对Dactylellina cionopaga基因PrD Ⅰ的表达

目的:Dactylellina cionopaga是产生黏性分枝的捕食线虫真菌,进行其基因外源表达是鉴定该菌侵染相关因子的途径之一。方法:该文构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体pGT21M-HIS,对D.cionopaga中与侵染机制相关的丝氨酸蛋白酶基因PrD Ⅰ进行了外源表达。结果:RT-PCR鉴定结果显示,PrDⅠ在黑曲霉201中获得了转录。SDS-PAGE和酶活分析结果表明,经亲和层析纯化的重组蛋白分子量约为45kDa,在pH 5.0的条件下具有蛋白水解活性。纯酶液的蛋白浓度为30μg/ml。结论:构建的带有组氨酸标签的表达载体pGT21M-HIS能够用于基因在黑曲霉表达系统中的外源表达,并为目的蛋白的纯化和鉴定提供了极大便利。黑曲霉外源表达系统在表达丝状真菌基因方面相对其他表达系统具有优势。     

NaCl胁迫及Ca2+和GA3对南瓜属3种蔬菜种子发芽的影响

研究了NaCl胁迫对南瓜(Cucurbita moschata Duch.)、笋瓜(C. maxima Duch.)和西葫芦(C.pepo L.)种子萌发的影响及不同浓度外源Ca2+和GA3对NaCl胁迫下南瓜种子发芽的效应.结果表明,用30 mmol·L-1NaCl处理,南瓜种子的发芽率高于对照(蒸馏水),而用100和170 mmol·L-1NaCl处理,西葫芦和笋瓜种子的发芽率下降率为负值,表明较低浓度NaCl胁迫可一定程度提高西葫芦、笋瓜和南瓜种子的发芽率;高浓度NaCl胁迫对种子发芽有明显的抑制作用.种子萌发期耐盐能力从大至小依次为西葫芦、南瓜、笋瓜.在170 mmol·L-1NaCl胁迫下,施加5～30 mmol·L-1外源Ca2+或浸种处理,对南瓜种子发芽有促进作用,但高浓度外源Ca2+(≥50 mmol·L-1CaCl2)则具有抑制作用.在170 mmol·L-1NaCl胁迫下,用不同浓度GA3浸种处理,对南瓜种子发芽有抑制作用.     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)GICC2773基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1．4kb和下游约1．3kb两段DNA序列,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5′和3′端,构建成重组质粒pMW1-pepB,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体-PEG方法,将酶切pMW1-pepB得到的线性片段转化A．niger GICC2773菌株,通过潮霉素选择平板得到62个Hgy抗性转化子,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB29。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降,外源蛋白漆酶的分泌表达有所提高。     

利用标记基因检测转Bt基因棉种子纯度的研究

安徽农业大学植保系李长福、吴振廷、王学林等研究人员根据转Bt基因棉国抗 1号转入的外源基因中整合有GUS基因和NPTⅡ基因 ,建立了 3种种子纯度检测方法 ,即GUS组织化学染色法、NPTⅡ培养法和NPTⅡ叶片涂抹法 ,准确率达到 98% ,在检测转Bt基因棉原始群系 2 0 - 1时 ,与生物测定比较准确率同样在 98%。为此 ,这 3种方法可用转Bt基因棉扩大规模制种过程中和推广应用良种纯度的检测 ,相应方法同样适用于基因组中整合有GUS基因和NPTⅡ基因的其他转Bt基因棉的品种。不仅如此 ,还适用于携带同一Bt杀虫蛋白基因的所有转Bt基因植物。同时…     

外源质粒pcDNA3s疫苗在小鼠体内组织代谢动力学研究

为分析外源质粒pcDNA3s肌肉注射后在小鼠体内的组织分布及评价整合到宿主基因组上的可能性．通过PCR方法检测质粒pcDNA3s经肌肉注射在各组织中的分布及随时间变化的情况．检测外源质粒在基因组DNA上的整合情况．注射后3h所有的组织均能检测到质粒,至第3周时只有胸腺和生殖器官能检测到质粒的存在,至第6周后各组织均为阴性、各组织基因组DNA经PCR扩增均为阴性．肌注外源质粒后,外源质粒在小鼠细胞内逐渐被清除,外源质粒不会整合到宿主染色体上．     

基因枪法在水稻工程育种中的应用

至今,基因枪法以其实用性和有效性应用于水稻工程育种已有十几年。本文阐述了其在水稻工程育种的六个主要领域的应用现状,同时评价了外源基因在转基因水稻中的稳定性和对转基因水稻主要农艺性状的影响。当然,基因枪法的转化效率还有待提高,随着转不同基因的工程水稻的日益增多,进一步的安全性试验显得十分必要,它是转基因水稻商品化的前提。     

红树DNA导入茄子获得耐盐性后代的研究

将海滩耐盐植物红树DNA经花粉管通道导入茄子,其后代在海滩试种,用海水直接浇灌,筛选出耐盐性转化株,约90％能开花结果,完成生长周期,并对其在盐胁迫下的生长情况,蒸腾速率,光合速率,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活以及叶片气孔的电镜观察等进行了研究,实验结果表明,通过花粉管道通导入红树DNA培育的茄子,其耐盐能力明显增强。     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置：胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和途径。     

豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析

从豌豆基因组中分离出一段具有核基质结合区(matrix attachment region,MAR)特征的DNA序列,与已知序列相比,获得的序列中部缺失了115bp的重复序列.重复序列上、下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性,并具有A-box,T-box和TATAAA等典型的MAR序列特征.为验证此DNA序列的功能,以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)作报导基因构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化了烟草.GUS定量检测表明,由于此DNA序列的存在,uidA基因的平均表达水平提高了2倍,最高的单株可达6倍.上述结果表明,该DNA具有MAR序列的特征序列,并且具有增加转基因表达的功能.