实时定量RT-PCR技术及在植物基因表达分析中的应用

近年来实时定量RT-PCR（real-time quantitative RT-PCR,qPCR）由于其具有敏感性,广阔的动力学范围,可靠性的特点,成为基因表达研究的标准方法。介绍了实时定量RT-PCR的原理和实验过程中的潜在问题,并且讨论了实时定量RT-PCR在植物基因表达研究中的应用。     

碱性成纤维细胞生长因子在苜蓿中的表达

为了降低bFGF(basic fibroblast growth factor)的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索.将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中.利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基+20 mg/L卡那霉素(Kan)+200 mg/L特美汀(Tim)中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株.再生植株通过PCR检测、RT-PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达.获得含有目的蛋白的阳性植株.为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础.     

藏黄牛β-乳球蛋白基因启动子部分序列特征

目的:阐明藏黄牛、牦牛、中国荷斯坦牛β-乳球蛋白(β-Lg)遗传变异体在乳中表达差异的分子基础。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定乳中β-Lg遗传变异体及其相对表达量,然后利用PCR方法扩增β-Lg启动子部分序列(375bp)并直接测序。结果:在杂合型β-Lg个体中,中国荷斯坦牛乳中β-Lg A的相对表达量(63.7±2.9%)均一致性地高于β-Lg B,而藏黄牛乳中二者比例十分接近,但个体差异差异较大。16个测序样品中共检测到13处碱基突变,其中有5处为牦牛特异的。另外,在牦牛β-Lg启动子-452与-453之间,还存在一个插入碱基。结论:β-Lg启动子-430碱基在中国荷斯坦牛中表现为等位基因特异的,而在藏黄牛中无等位基因特异性。     

诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达的调控

一氧化氮（ＮＯ）自由基有多方面的生物学功能。随着研究的深入,发现ＮＯ能与超氧阴离子（Ｏ－２·）反应生成激发态亚硝酸（ＯＮＯＯＨ＊）,它与靶分子能产生羟自由基（·ＯＨ）和二氧化氮（ＮＯ２）样反应,在体内原先认为的一些ＮＯ效应,现在知道主要是由于ＯＮＯＯ...     

HFRSV在平皿表面室温暴露后存活力的定量研究

将肾综合症出血热病毒布于玻璃平皿表面,室温条件下分别暴露0、30、60、90和120min,观察病毒的定量存活情况.结果在经过120min的暴露后,HFRSV的效价仍高达104.23 TCID50.这一结果为HFRS的流行病学及其防治研究提供了重要的基础数据.     

水菠菜叶乙醇提取物对MG-63骨质疏松相关基因表达的影响

为探讨水菠菜叶乙醇提取物与抗骨质疏松作用的关系及其作用机制,用水菠菜叶乙醇提取物处理人成骨样细胞MG-63 48 h后,提取水菠菜叶乙醇提取处理组和对照组细胞的总RNA,将两组RNA纯化为mRNA,逆转录成cDNA,用Cy3和Cy5两种不同的荧光染料进行线性扩增标记,然后与骨质疏松相关基因表达谱芯片杂交,扫描后对获得的数据用LuxScan 3.0软件分析.研究发现经水菠菜叶乙醇提取物诱导后MG-63细胞的244个骨质疏松相关基因中,有c-Fos、JNK、ODF、c-src、OSCAR、RANKL、Samd4、Samd6、Samd7 9个基因表达明显上调,LRP5、Dkk1、TGFB、OPG 4个基因明显下调.结果表明水菠菜叶乙醇提取物能改变骨质疏松相关基因的表达,抗骨质疏松作用机制可能与Wnt/β-catenin蛋白信号传导途径和骨保护素/核因子受体激活信号传导途径有关,与雌激素内分泌途径无关.     

非吞噬细胞NAD(P)H氧化酶生成的活性氧参与基因表达和信号转导

以前认为,NAD(P)H氧化酶仅存在于吞噬细胞,负责吞噬细胞呼吸爆发时产生活性氧(ROS)以杀灭微生物。现在发现正常非吞噬细胞也有NAD(P)H氧化酶,称之为类NAD(P)H氧化酶。该酶在生长因子和细胞因子的刺激下,介导非吞噬细胞产生胞内或胞外的ROS,通过此途径产生的ROS对细胞增殖、分化和血管形成和缺氧反应等生理过程至关重要。这些新的发现。有力地证明了ROS作为细胞“信号分子”和“基因表达开关”的积极作用,改变了过去只把ROS看作有害物的误解。     

针对多效蛋白基因的小干扰RNA的设计及其稳定表达载体的构建

目的:设计多效蛋白基因特异性的小干扰RNA(siRNA),并构建一系列能在哺乳动物细胞内稳定表达这些siRNA的表达质粒,以便为在体外研究多效蛋白基因的功能打下基础。方法:设计并合成具有多效蛋白基因特异性的一组寡核苷酸片段,并克隆到pSilencer3.1-H1hygro载体;用脂质体LipofectAMINE2000转染和潮霉素筛选等方法建立能稳定表达相应siRNA的一组Pten-/-细胞克隆;利用Northern印迹检测这些细胞内多效蛋白基因的表达情况。结果:设计并构建了3个针对多效蛋白基因的siRNA表达质粒,并证明其中的1种质粒能在Pten-/-细胞内稳定表达相应的siRNA,并显著地抑制了该细胞多效蛋白基因的表达。结论:设计并构建出的针对多效蛋白基因的siRNA表达载体所表达的siRNA具有较强的RNA干涉功能,为多效蛋白基因的功能研究奠定了实验基础。     

应用基因表达谱芯片研究黄药子对小鼠肝脏的毒性机制(简报)

黄药子为薯蓣科植物黄独(Dioscorea bulbifera L．)的块茎,临床常用于治疗甲状腺肿、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等。近年来临床上关于黄药子的毒副作用,尤其是对肝、肾的不良反应屡有报道。当黄药子或其代谢物在肝细胞内累积时会直接干扰肝细     

细胞信号转导与可变剪接调控

大多数真核基因能够发生可变剪接,其调控对于生理和病理状态下细胞功能的实现至关重要,而异常可变剪接则可导致多种疾病。虽然已知可变剪接能够在转录后水平调节基因表达,然而目前仍不清楚特定的可变剪接模式是如何被调控的。越来越多的研究发现细胞信号和外界环境刺激能够调控靶基因的剪接模式,并且已发现一些与可变剪接调控有关的信号转导通路,而后者能够通过修饰剪接因子进而改变剪接因子的亚细胞定位或者活性,从而实现对靶基因可变剪接模式的调控。由细胞信号转导通路所构成的网络能够灵活多样地调控基因剪接,一条信号通路可调控多个基因剪接,而多条信号通路也可调控同一基因剪接,对于理解信号转导过程的分子机制具有重要意义。