定点突变法对人白细胞介素～2C末端α螺旋的结构和功能研究

用寡核苷酸诱导的基因定位突变法,将人白细胞介素－2C末端两亲性α螺旋中125位和127位残基分别或同时突变为Pro,并测定其生物活性和空间结构。结果发现所得突变体的生物学活性均急剧下降,同时α螺旋含量以及C端螺旋中残基的空间位置也发生了不同程度的变化。结果提示,C端α螺旋尤其是其疏水面的完整性对维持白介素－2的生物活性有重要作用。     

番木瓜果糖-2,6-二磷酸酶CpF2KP基因克隆和蛋白表达纯化

番木瓜是岭南四大名果之一,在我国东南部地区广泛种植,因其具有食用和药用双重价值,因此深受人们的青睐。果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase,F2KP)是一个独特的双功能酶,具有激酶功能域和酯酶功能域,能催化生物体内糖代谢的重要调节物果糖-2,6-二磷酸(Fru-2,6-P_(2))的合成和降解。为了研究番木瓜中编码该酶的基因CpF2KP的功能,得到目的蛋白尤为重要。本研究从番木瓜基因组中提取到CpF2KP基因的编码序列(coding sequence,CDS)序列,该基因CDS全长2274 bp。将该基因CDS全长扩增之后选用pGEX-4T-1载体进行原核表达。对载体pGEX-4T-1用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切,利用基因重组的方式将扩增序列构建到原核表达载体上。经过诱导条件探索,SDS-PAGE结果显示GST-CpF2KP重组蛋白的大小约为110 kDa,诱导CpF2KP蛋白表达的最适条件为:异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度为0.5 mmol/L,温度28℃。对诱导后的CpF2KP蛋白进行纯化,得到了纯化的单一目的蛋白。此外,检测了该基因的组织表达特性发现该基因在种子中表达量最高,在果肉中表达量最低。该研究为进一步深入揭示番木瓜CpF2KP蛋白的功能及研究该基因参与的生物学过程提供了重要基础。     

乙醛脱氢酶基因ALDH2对雄性小鼠生育能力的影响

本研究使用乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因全敲除的雄性C57BL/6(B6)小鼠（Musmusculus domesticus）,通过分析不同周龄小鼠的睾丸脏器系数、睾丸组织细胞形态、精子运动参数、配种后母鼠产仔数及子代雄雌比等生育指标,探讨ALDH2基因敲除对雄性小鼠生育能力的影响。结果表明,与野生型（WT）小鼠相比,5、7、10周龄ALDH2基因敲除型（KO）雄性小鼠睾丸脏器系数显著降低（P <0.05）;睾丸组织细胞间质变大,精子活率显著降低（P <0.05）;产仔数和雄雌比显著降低（P <0.05）。本研究为揭示乙醛脱氢酶ALDH2基因在雄性小鼠生殖中的作用提供了一定的基础。     

以A2型短指(趾)症为案例的医学遗传学PBL教学设计

医学遗传学是生物医学中的前沿学科,也是临床基因诊断和基因治疗的核心内容。在医学人才培养中,医学遗传学扮演着衔接基础医学与临床医学的重要角色。近年来,基于问题的学习(problem-based learning,PBL)作为培养医学生自主学习能力的重要方法,在医学教育中得到了广泛的应用。本文设计并分享了以A2型短指(趾)症(brachydactyly type A2,BDA2)研究为核心的PBL教学案例,以期引导学生自主学习,以能力培养代替知识传授,培养学生独立分析和解决问题的能力以及创新性思维的卓越学风,为健康中国建设输送更多具有国际竞争力的高素质医学人才。     

缺刻缘绿藻磷脂酶A2(PLA2)的基因特征与功能

为进一步鉴定磷脂酶A2(PLA2)在缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)油脂合成过程中的具体功能,研究利用RACE技术从缺刻缘绿藻H4301中克隆到pla2基因(Mipla2)的cDNA序列全长,共1082 bp。该全长包含180 bp的5′-非翻译区(UTR), 464 bp的3′-UTR和438 bp的开放阅读框(ORF),编码1个由145个氨基酸组成的蛋白。其基因全长为1594 bp,含有3个内含子和4个外显子。多序列比对结果显示, MiPLA2具有保守的Ca²⁺结合基序和催化活性基序。系统演化分析结果显示MiPLA2属于植物s PLA2-XIA家族。利用同源重组技术构建了pET32aMipla2原核表达载体,经过诱导和纯化,得到了分子量大小为31.36 kD的重组MiPLA2蛋白。体外酶促反应的产物经薄层层析分析显示,重组表达的MiPLA2具有催化磷脂酰胆碱(PC)水解成溶血磷脂酰胆碱(LPC)的功能。研究结果有助于解析花生四烯酸被优先用于三酰甘油(TAG)合成的途径与机理,为通过pla2基因的遗传改造提高该藻油脂产率的应用研究奠定了基础。     

抗SARS-CoV-2 S蛋白IgM单克隆抗体的表达及鉴定

为了寻求SARS-CoV-2 IgM抗体阳性血清质控品的替代品,本研究成功表达纯化出抗SARS-CoV-2 S蛋白IgM单克隆抗体。研究确定了IgM单克隆抗体最佳表达载体为含增强子sp163和信号肽2的组合以及第5d为目的蛋白收获的最佳时间。此外在研究J链的作用时发现转染细胞时不添加J链（nCoV-163-IgM3）的表达量明显高于添加J链（nCoV-163-IgM3 J）时的表达量,J链对蛋白稳定性也无明显影响,且nCoV-163-IgM3和nCoV-163-IgM3 J抗原结合活性之间的差别无统计学意义（P>0.05）,nCoV-163-IgM3和nCoV-163-IgM3 J对本研究所检测的WTS1、Alpha-S1、Beta-S1、Delta-S1、Omicron-S1、BA.2-S1、BF.7-RBD、XBB.1-S1、BQ1.1-S1等九种抗原均有结合活性,只有一株（BA.2.75-RBD）逃逸。纯化后的目的蛋白经还原剂（β-ME）还原后显示重链分子量大小为70kD左右,轻链分子量大小为25kD左右。目的蛋白均可与新型冠状病毒抗体检测试剂盒（胶体金,INNOVITA）...     

SARS-CoV-2入胞活细胞示踪平台的建立

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）由于其高传染性已造成全球大流行。目前关于SARS-CoV-2依赖内吞途径进入细胞的研究偏向于药物抑制实验或固定样品的蛋白共定位实验,而对于其入胞时与细胞内吞结构相互作用的动力学机制研究较少。本研究首先基于慢病毒系统包装出可在生物安全二级实验室（BSL-2）进行操作的SARS-CoV-2假病毒,之后利用膜染料对假病毒的囊膜进行荧光标记,并进行鉴定。通过免疫荧光方法观察到假病毒与网格蛋白包被的内吞结构共定位,进一步在网格蛋白敲低的Caco-2细胞系上进行假病毒感染,检测到荧光素酶活性显著下降,这些结果确定了网格蛋白介导的内吞作用参与假病毒感染。最后基于单病毒示踪技术,通过共聚焦显微镜对假病毒入胞过程进行活细胞实时拍摄,选取两个具有代表性的假病毒粒子依赖网格途径入胞的典型视野,并对假病毒动力学进行分析。本研究成功建立了SARS-CoV-2假病毒入胞活细胞示踪平台,可应用于研究单个假病毒粒子入胞过程动力学机制。该平台对SARS-CoV-2入胞机制的研究具有重大意义。     

SARS-CoV-2 Omicron变异株荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

开发和评价一种用于鉴别Omicron变异株的荧光定量PCR方法。我们针对Omicron变异株S基因的两个特异性突变位点开发了一种基于荧光定量PCR的Omicron变异株分型方法（Omicron RT-qPCR）。通过测试临床样本来评价方法的特异性,通过标准品评价方法的灵敏度。Omicron RT-qPCR分型方法显示能够可靠地区分Omicron变异株和“野生型” SARS-CoV-2及Alpha、Beta、Delta变异株及甲型流感病毒。选取68例新冠疑似样本,全基因组测序（Whole genome sequencing,WGS）结果显示44例为Omicron变异株,Omicron RT-qPCR分型结果均为阳性;11例为Delta变异株,Omicron RT-qPCR分型结果均为阴性;另外,通过WGS分析未能成功分型的7例样本,通过Omicron RT-qPCR分型方法成功鉴定为Omicron BA.1和BA.2变异株。我们开发的Omicron RT-qPCR分型方法可以在普通的PCR检测实验室应用,为我国疾控系统和医疗机构及时监测SARS-CoV-2 Omicron变异株的传播提供...     

虎杖转录因子PcMYB2的表达特性和功能分析

对虎杖R2R3-MYB转录因子PcMYB2进行转录活性鉴定和表达特性分析,并在转基因拟南芥和转基因毛状根中进行功能研究。利用酵母单杂交试验分析PcMYB2的转录活性;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测虎杖中PcMYB2的表达模式;DMACA法检测PcMYB2转基因拟南芥和虎杖毛状根中的原花青素含量。酵母单杂试验表明,PcMYB2具有转录激活活性;RTqPCR结果显示,PcMYB2在虎杖根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高,并且ABA和H₂O₂外源处理可诱导叶片中PcMYB2的表达;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥种皮颜色加深,原花青素含量为野生型的1.8倍;与野生型毛状根相比,转基因毛状根DMACA染色更深,原花青素含量为野生型的2.3倍。PcMYB2具有转录激活活性,且促进植物原花青素的生物合成。     

5-羟色胺在红树植物秋茄幼苗抗寒中的作用

5-羟色胺(5-HT)不仅能参与植物的生长发育,还可以延缓衰老及应对非生物胁迫。为探明5-HT在调控红树林抗寒中的作用,以红树植物秋茄为试验材料,研究抗寒锻炼和喷施DL-4-氯苯丙氨酸(p-CPA, 5-HT合成抑制剂)对低温胁迫下秋茄幼苗叶片气体交换参数、CO₂响应曲线(A/Ca)和内源植物激素含量的影响。结果表明：低温胁迫显著降低了秋茄幼苗叶片5-HT、叶绿素、内源生长素(IAA)、赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)含量,减弱了其利用CO₂的能力,降低了净光合速率,抑制了初始羧化效率。低温胁迫下施用外源p-CPA降低了秋茄幼苗叶片光合色素、内源各激素和5-HT含量,加剧了低温胁迫对秋茄幼苗叶片光合功能的伤害。抗寒锻炼可有效降低低温胁迫下秋茄幼苗叶片内源IAA含量,促使植株产生更多的5-HT,提高了叶片光合色素、GA、ABA含量和初始羧化效率,提升了光合碳同化能力,最终提高了秋茄幼苗叶片的光合作用;抗寒锻炼下喷施p-CPA会显著抑制秋茄幼苗叶片5-HT合成,促进IAA产生,同时降低光合色素、GA、ABA含量和初始羧化效率,减弱抗寒锻炼对红树林...