牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a( )载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。     

快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子瞬间表达特性的方法

选择合适的诱导表达启动子是开展植物耐干旱和脱水等非生物逆境转基因研究的重要环节。我们通过几年的研究,已建立了一套以大麦幼苗完整活体和植物离体叶片为主要材料通过瞬间表达鉴定来快速检测干旱和脱水可诱导基因启动子表达特性的方法。来自大麦和水稻的启动子Dhn4s、Dhn8s、HVA1s、Rab16Bj、wsi18j在大麦、小麦、水稻、高粱和蕨类植物的离体叶片中经干燥诱导可以瞬间表达GFP,在绿豆、番茄叶片中不表达。鉴定了HVA1s和wsi18j在大麦不同器官或组织中启动子的定性表达情况。进一步建立了GFP荧光点/GUS染色点计数分析和GUS活性/XYN活性测定分析的启动子表达的定量分析方法,并讨论该方法在环境可诱导植物启动子功能分析中的应用价值和前景。     

植物性转基因食品的检测与验证方法

厦门大学生命科学学院刘光明、宋思扬、龙敏南等6位科研人员根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子（CaMV35S）和根癌农杆菌终止子（NOS）的序列。设计并合成了两对不同的引物,建立了PCR-酶切分-Soutllem杂交检测并确定认为转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法,并用此法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行检测,发现13份样品中有6份检出35S启动子和NOS终止子,7份样品结果为阴性。     

人IFN-β启动子基因报告质粒的构建及SARS-CoV3a和7a蛋白对IFN-β诱生作用的初步研究

3a蛋白和7a蛋白是SARS-CoV的非结构蛋白,分别主要由SARS基因组中ORF 3a 和ORF 7a所编码。在体内和体外感染病毒的细胞中均发现了有3a蛋白的表达。首先将pGL3-Control载体进行了改构,除去了SV40启动子基因,获得了pGL3-Enhancer载体,将获得的IFN-β启动子基因连入载体中,构建了带有人IFN-β启动子基因的荧光素酶报告质粒IP-21,并且通过实验证明所构建的质粒在干扰素的诱导剂NDV的作用下能够表达荧光素酶活性,照度计检测荧光素酶活性增强,从而验证了所构建的重组质粒的有效性。为了观察SARS-CoV非结构蛋白3a和7a对干扰素诱生途径的影响,将IP-21瞬转入稳定表达有3a和7a蛋白的CHO细胞,通过荧光素酶的信号强弱对3a和7a的作用进行分析,结果表明SARS-CoV的3a和7a蛋白能够刺激荧光素酶的表达,即在体外的细胞实验中,3a和7a能有效地激活IFN-β的启动子部分。此结果对进一步研究3a和7a的功能以及对SARS-CoV的致病机制的进一步研究有一定意义。     

一种基于多特征的大肠杆菌启动子判别算法

主要对从一段DNA序列中提取出信息以判别其中是否含有启动子的问题进行了研究。首先从固定长度的序歹4中提取成分特征和结构特征,然后将这些特征输入到一个非线性分类器中进行判别。测试结果显示,在正集＆非编码区负集中,平均错误率降低为13．4％;在正集＆编码区负集中,平均错误率降低到17．0％。表明该方法是非常有效的。     

Gassericin T基因的合成及其组成型表达载体的构建

目的:构建Gassericin T基因毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型表达载体。方法:根据乳酸菌素Gassericin T的基因序列,把Gassericin T的结构基因gatA编码的氨基酸的密码子转换成P.pastoris偏爱的形式,设计了6条59nt的寡聚核苷酸引物,通过3次连续PCR反应,获得了250bp左右的gat A片段(简称gat基因)。应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的pAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将合成的gat基因克隆到pGAP9K质粒的多克隆位点中。结果:获得的gat及gap基因与预期结果一致,序列无碱基突变,构建的表达载体pGAP9K-gat经PCR、酶切鉴定完全正确。结论:成功构建了Gassericin T基因P.pastoris组成型表达载体,为下一步高效表达Gassericin T蛋白,进一步研究其作用机理及应用价值打下基础。     

人脑胶质瘤GDNF基因启动子I区H3组蛋白乙酰化修饰情况

目的：明确GDNF启动子I区在人脑胶质瘤中H,赖氨酸残基9位乙酰化（H3K9Ac）情况,探讨其对于GDNF在胶质瘤中表达的影响。方法：RT-PCR检测各组中GDNFmRNA的表达;建立基于Real．timePCR分析的染色质免疫共沉淀（CHIP）方法,检测12例胶质瘤与6例正常脑组织中GDNF基因启动子I区王H3组蛋白乙酰化情况。结果：Real-timePCR验证人脑胶质瘤GDNFmRNA的表达,转录水平随级另q的增高而增高,且低级别组、高级别组与正常组之间存在显著的统计学差异（P〈0．05）。启动子I区的H,组蛋白乙酰化水平,正常组与低级别组和高级别组之间比较均有显著性差异（P〈0．05）,且低级别与高级别之间也有显著性差异。结论：在人脑胶质瘤组织中,GDNF启动子I区发生了H3组蛋白高乙酰化修饰,这种修饰很可能会影响GDNF基因的表达。     

生长因子颗粒蛋白前体和肿瘤坏死因子受体基因启动子区改变与阿尔茨 海默病的相关性研究

目的:探讨生长因子颗粒蛋白前体(PGRN)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因启动子区改变以及全基因组DNA甲基化与阿尔茨海默病的相关性。方法:收集阿尔茨海默病患者血液样本80例以及健康对照血液样本80例,PCR扩增PGRN和TNFR基因启动子区并进行测序,观察两组间的单核苷酸多态性位点是否有差异。同时,用甲基化特异性PCR法检测启动子区DNA甲基化情况以及用ELISA法检测全基因组DNA甲基化水平。结果:在TNFR基因启动子区域发现阿尔茨海默病和对照组之间在多态性位点rs4149570和rs4149569有显著性差异(P0.001和P=0.033)。阿尔茨海默病患者全基因组甲基化水平为(0.79±0.29)%,显著低于对照组的(1.00±0.36)%(P0.001)。结论:TNFR基因多态性位点rs4149570和rs4149569的变异可能与阿尔茨海默病相关,全基因组甲基化水平降低可能与阿尔茨海默病相关。     

棉花杜松烯合成酶基因的克隆及其表达分析

杜松烯合成酶是棉酚合成途径中的关键酶,催化(E,E)-法呢基焦磷酸(FPP)环化形成(+)-δ-杜松烯。从陆地棉Y18R中克隆分离了杜松烯合成酶基因(GhCdn),该基因的基因组序列为2 700 bp,具有6个内含子,剪切后其ORF为1 665 bp,编码554个氨基酸,该基因属于杜松烯合成酶C亚家族。应用Overlap PCR方法将其上的2个Hind Ⅲ 酶切位点钝化后,将GhCdn基因连接到表达载体pBI121上,构建出分别由组成型启动子CaMV 35S和绿色组织高效启动子Psbp驱动的2个植物表达载体pGBI-CaMV 35S-GhCdn和pGBI-Psbp-GhCdn。通过农杆菌介导法转化棉花下胚轴并进行组织培养,获得了9个35S转基因阳性愈伤系和2个P转基因阳性愈伤系。经检测,阳性愈伤组织中GhCdn基因的mRNA表达量和棉酚含量均有所增加,但35S系普遍高于P系。本研究为通过基因工程手段提高棉花组织器官中的棉酚含量提供了依据。