vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

标记蛋白HPT的表达、纯化及免疫活性鉴定

构建含有HPT的原核表达质粒,经诱导表达纯化后获得HPT抗体。从含有hpt的质粒pCambia1301上扩增目的基因,经SalⅠ和NotⅠ双酶切后与原核表达载体pET-28b（+）进行粘性末端连接,成功构建了pET-28b-hpt质粒,并转化到宿主细菌大肠杆菌Rosset(DE3)中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET-28b-hpt原核表达载体在E.coli Rosset菌株中以包涵体的形式高效表达了HPT蛋白,并以纯化的目的蛋白为抗原免疫兔制备了多克隆抗体。利用本方法可以获得特异性强、灵敏度高的多克隆抗体。     

重组蛋白GST-OsCATB的表达特性研究

为了阐明水稻Catalase（CAT）的酶学功能,首先需要获得出足量的、活性的该酶蛋白。本研究克隆了水稻OsCAT_B基因(GenBank accession No.D26484),构建到原核表达载体pGEX-6p-3中形成重组蛋白,继而转入E.coli菌株BL21中进行表达特性研究。结果表明,GST-OsCAT_B融合蛋白在E.coli中进行了过量表达,表达受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度和诱导体系等多因素影响;通过谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析,纯化出足量、活性的融合蛋白GST-OsCAT_B,每克表达细胞（干重）中得率为51 mg GST-OsCAT_B。     

《自然》:研究发现决定人抗压能力的蛋白

日前一国际研究小组发表在《自然》杂志上的报告称,是人大脑中的neuropsin蛋白活性决定了应激行为的模式,该蛋白信号通路让某些人在压力面前更显脆弱。     

前列腺癌多阶段相关枢纽蛋白的差异共表达模式

通过枢纽蛋白与其互作邻居之间的共表达关系在从前列腺正常组织到原位癌及原位癌到转移的两个发展阶段的变化,寻找在前列腺癌发生和发展过程中动态改变的枢纽蛋白,为探讨前列腺癌的发病与转移机理提供线索。基于前列腺正常组织、原位癌与癌转移后组织的基因表达谱数据,在前列腺癌的两个发展阶段分别检测到1578和2347个动态改变的枢纽蛋白。平均超过95%的在一个发展阶段动态改变的枢纽蛋白与在另一发展阶段动态改变的枢纽蛋白中的至少一个蛋白共享显著多的互作邻居。另外,两组动态改变的枢纽蛋白中有780个交叠蛋白,其中大约50%的蛋白与其互作邻居之间的共表达关系在两个发展阶段的强弱变化方向相反。结果提示,在前列腺癌的发生和发展过程中,动态改变的枢纽蛋白影响的功能通路高度一致,但是它们与其互作邻居之间有着不同的共表达模式。     

抗肿瘤疫苗MAGE1-MAGE3-HSP70蛋白特性及其纯化策略的研究

目的:对MAGE1-MAGE3-HSP70(M1-M3-HSP70)融合蛋白的理化性质及其纯化策略进行初步研究,为后期的临床前试验提供数据和依据。方法:以本实验室构建的菌种(BL21(DE3)pLysS-M1-M3-HSP70)为材料,采用常规细菌培养及诱导方法进行诱导表达,用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、免疫印迹(Western blotting)对目的蛋白进行分析,然后确定盐析条件,使用ButylSepharose HP疏水相互作用层析以及阴离子交换(Source 30Q填料)对目的蛋白的纯化进行分析。结果:M1-M3-HSP70蛋白在大肠杆菌中表达后,目的蛋白分为两部分,一部分为包涵体形式(44.9%),一部分为可溶表达(55.1%)。对其可溶部分进行研究发现,细菌裂解后,目的蛋白存在聚合和降解现象;确定了盐析条件、洗脱缓冲液以及稳定的PH值范围,基本确定了目的蛋白的纯化工艺。结论:明确了M1-M3-HSP70融合蛋白的基本性质,确定了目的蛋白的纯化方法,为基于融合蛋白的肿瘤疫苗的进一步研究提供了参考。     

进行性骨化性纤维增殖不良症临床及基因突变分析

目的:研究一例具有超经典型临床特征的FOP患者,并对其ACVR1/ALK2基因进行分析。方法:根据患者的大踇趾畸形和进行性异位骨化等表现进行临床诊断,确诊为FOP。经患者及家属同意,采集患者、父母外周血,提取DNA,通过PCR扩增并直接测序测定ACVR1基因全部外显子序列,以此来确定突变位点。结果:患者具有超经典型FOP的临床表现:先天性大踇趾畸形,先天性双手拇指、食指远端关节僵直和进行性异位骨化,父母无FOP的相关临床表现。基因测序分析示该患者在ACVR1第七外显子发现存在c.1067G>A(p.G356D)杂合错义突变,而其父母无此杂合突变。结论:该患者在ACVR1的c.1067G>A(p.G356D)发生杂合错义突变,这有助于我们更好地理解认识中国FOP患者的临床表现和发病机制。     

吸烟大鼠肺脏AQP4 和MUC5AC 的表达及其与 一氧化氮的关系

目的:研究烟草烟雾吸入对大鼠肺组织水通道蛋白4(AQP4)和粘蛋白5AC(MUC5AC)表达的影响及其与支气管肺泡灌洗液内一氧化氮代谢物水平的关系,探讨氧化应激对肺部水转运和粘液分泌的影响。方法:免疫组化法观察AQP4在肺组织内的表达,平均光密度法比较模型组和空白组大鼠AQP4的表达差异;半定量RT-PCR法检测肺组织内AQP4及MUC5AC mRNA的表达水平;硝酸还原酶法测定各组大鼠支气管肺泡灌洗液内一氧化氮代谢产物的浓度,分析模型组AQP4、MUC5AC mRNA的表达水平与支气管肺泡灌洗液内一氧化氮代谢物浓度之间的相关关系。结果:AQP4在空白对照组呈强阳性染色,在模型组呈弱阳性染色,两者平均光密度值有显著差异(P<0.05)。模型组动物肺组织AQP4 mRNA的表达降低,MUC5AC mRNA的表达升高,与空白组比较均有显著差异(P<0.05),模型组动物支气管肺泡灌洗液内一氧化氮代谢产物的浓度与肺组织AQP4 mRNA表达水平呈负相关,相关系数r=-0.798(,P<0.05),与MUC5AC mRNA的表达水平呈正相关,相关系数r=0.857(,P<0.05)。结论:吸烟可导致肺组织AQP4表达下降进而影响气道内水的转运。一氧化氮可能参与了烟雾吸入动物模型中AQP4与MUC5AC基因表达的调控。     

新生儿缺氧缺血性脑病血清S-100B蛋白与NBNA评分动态监测 的临床研究

目的:观察新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE)血清S-100B蛋白的动态变化规律,探讨其在HIE早期诊断中的价值,以及其浓度变化与病情严重程度及预后的关系。同时研究围产期高危因素以及NBNA评分在HIE发生发展与预后中的作用。方法:30例住院正常新生儿作为对照组,于出生后采血,55例HIE患儿(HIE组)分别于出生后1天、2天、7天采血,采用酶联免疫吸附试验、双抗体夹心法检测。收集并分析两组围产期相关资料。HIE组并于采血同时进行NBNA评分。结果:(1)HIE患儿生后第一天与第二天血清S-100B蛋白浓度明显高于对照组(P<0.05),生后第七天轻度HIE与对照组比较没有统计意义,中、重度HIE与对照组比较有统计学意义。(2)生后第一天与第二天不同病情组HIE患儿NBNA评分相互比较差异具有统计学意义(P<0.05),第七天轻、中和重度患儿NBNA评分<35分的患儿分别占33.3%,47.1%,100%。结论:动态监测HIE患儿血清S-100B蛋白浓度和NBNA评分的变化,对HIE的早期诊断,严重程度的判断以及预后的估计有重要意义。     

急性脑梗死患者相关生化指标检测的临床意义

目的:探讨急性脑梗死(ACI)患者治疗前后Hcy、ET-1、hs-CRP、TXA2水平和凝血纤溶指标的变化及临床意义。方法:分别采用ELISA法、发色底物法、凝血酶法、放射免疫法和免疫透射比浊法对68例ACI患者治疗前后Hcy、ET-1、hs-CRP、TXA2和各凝血纤溶指标水平进行检测,并以30例正常健康人作为对照组。结果:①ACI患者治疗前血浆Hcy、ET-1和血清hs-CRP、TXA2含量高于对照组(P<0.01),经过治疗,含量均明显下降,其中血浆Hcy、ET-1恢复至正常水平,与对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)②轻、中、重型组间血浆ET-1和血清hs-CRP、TXA2含量逐渐增加,组间差异有显著性(P<0.01或0.05),而中重型患者血浆Hcy含量明显高于轻型患者(P<0.01)。③经过治疗,ACI患者血浆vWF、GMP-140、Fg和F1+2含量较治疗前显著下降,而血浆PS活性、PC活性与AT水平较治疗前明显上升(P<0.01),其中血浆PS和PC活性与对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。④ACI患者血浆中tPA水平低于对照组,血浆PAI-1含量高于对照组(P<0.01)。治疗后血浆tPA增加,与对照组间差异无统计学意义(P>0.05),PAI-1减少,但仍显著高于对照组(P<0.05)。结论:检测急性脑梗死(ACI)患者Hcy、ET-1、hs-CRP、TXA2和凝血纤溶指标水平的变化对于指导用药、病情观察和预后评估均有重要的临床意义。