丹参综合提取分离及丹参酮ⅡA磺酸钠制备工艺研究

本研究以陕西商洛所产丹参为原料,对丹参中主要有效成分的同步综合提取工艺进行了优化。优化后的提取工艺为:乙醇浓度为80%,料液比为1∶25,提取时间3h,提取温度60℃。提取液浓缩至比重1.05后加入4倍量(mL/g)的水沉淀,过滤,将水溶性成分和脂溶性成分分离。水液以大孔树脂吸附,水洗脱,得到丹参素和原儿茶醛的水洗液。水洗脱后的树脂以40%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液得到丹酚酸B;提取浓缩液水沉后的沉淀干燥,以苯溶解,过滤,滤液以中性氧化铝柱层析,得到各种单体成分。优化后的纯化工艺各成分的得率为:原儿茶醛3.6%,丹参素1.2%,丹酚酸B5.5%,丹参酮I 0.23%,丹参酮ⅡA 3.8%,丹参酮IIB 0.72%,隐丹参酮0.18%,丹参酸甲酯0.09%;含量分别为:98.3%,99.2%,91.7%,97.2%,98.8%,98.5%,97.6%,98.3%。以配料比、反应时间、反应温度和溶液碱度为影响因素,采用最陡坡实验法对水溶性化合物丹参酮ⅡA磺酸钠的制备工艺进行了优化,得率为86.2%,含量为96.7%。     

基于重组大肠杆菌无细胞体系生产吡咯喹啉醌

采用无细胞体系生产吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)。首先将肺炎克雷伯氏菌PQQ基因簇pqqABCDEF置于半乳糖苷酶启动子之下,构建表达载体,经转化筛选获得重组大肠杆菌。制备重组菌的细胞匀浆,体外反应后测定PQQ产量。结果显示,与活体重组菌相比,无细胞体系的PQQ产量提高约30%,表明胞内存在PQQ合成的限速反应,而无细胞体系可解除此限速反应。     

吡咯喹啉醌对大型溞繁殖、发育、存活和抗饥饿能力的影响

研究了吡咯喹啉醌（PQQ）对大型溞繁殖、发育、存活时间以及抗饥饿能力的影响。结果表明,5μmol/L的PQQ能够显著促进大型溞的繁殖能力,总产幼量从159.5只增加到207.67只（P〈0.05）。随着浓度增加到15和25μmol/L,其促繁殖效应有所减弱。与对照组相比,PQQ对大型溞发育过程中的龄期数和存活时间（寿命）无显著影响（P〉0.05）。然而,与5μmol/L浓度组相比,15和25μmol/L的PQQ却显著降低了大型溞的龄数和存活时间（P〈0.05）。PQQ能够明显提高大型溞的抗饥饿能力,最长存活时间从对照组的3 d增加到0.5 mmol/L PQQ组的8.33 d（P〈0.05）。     

甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究

目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。     

一株产苝醌类光敏剂丝状真菌AL18的液体发酵工艺研究

为研究一株丝状真菌AL18产艹北醌类光敏剂的液体发酵工艺。以马铃薯综合培养基为发酵培养基,采用单次单因素实验法,研究了液体摇瓶培养条件对艹北醌类光敏剂产量的影响。实验结果表明:液体摇瓶最适培养条件为250ml三角瓶装液量40ml,接种量7.5%,接种种龄40h,初始pH5.75,摇床转数180r/min,30℃振荡培养48h。在此培养条件下,采用单因素法筛选了发酵培养基中的碳源、氮源和无机离子,选用L9(34)对筛选到的绵白糖(A)、蛋白胨(B)、蚕蛹粉(C)、CuSO4.5H2O(D)进行了正交试验。经优化后的发酵培养基配方为:马铃薯200g/L,绵白糖30g/L,蛋白胨3g/L,蚕蛹粉12.5g/L,磷酸二氢钾1g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸铜0.05g/L,VB1100mg/L。对此发酵培养基配方进行了5次验证实验,艹北醌类光敏剂的平均产量为1.21g/L。     

2,3-吲哚醌对MCF-7和HT-29细胞株的增殖抑制和凋亡诱导

目的:研究2,3-吲哚醌(2,3-dioxoindoline,ISA)对人乳腺癌细胞株MCF-7和人大肠癌细胞株HT-29的增殖与凋亡影响.方法:应用MTT比色法检测ISA对MCF-7和HT-29的生长抑制情况;Hochest33258荧光染色法检测细胞凋亡情况,Westem Blotting 法检测凋亡相关基因bcl-2和bax在蛋白水平上的表达;RT-PCR两步法检测bcl-2和bax在mRNA水平上的变化.结果:①ISA在一定浓度范围内能明显抑制细胞生长;②荧光染色可观察到细胞核染色质浓集,核浓缩核碎裂,并出现典型的凋亡小体;③bcl-2 mRNA及蛋白的表达随药物浓度增大而逐渐减少,各实验处理组与阴性对照组比较存在统计学差异(P＜0.05或P＜0.01).bax mRNA及蛋白的表达随药物浓度增大而无明显变化,各组间比较不存在统计学差异(P＞0.05).结论:ISA能够抑制MCF-7和HT-29细胞增殖,并能进一步诱导其凋亡,其作用机制可能是与下调bcl-2表达有关.     

甲基营养菌甲醇脱氢酶基因的克隆及表达

目的:从甲基营养菌MP681中扩增甲醇脱氢酶(MDH)基因,在大肠杆菌中表达并检测其活性,同时在MP681中考察该基因对吡咯喹啉醌(PQQ)产生的影响。方法:根据MP681基因组序列设计引物,PCR扩增靶基因mdh,构建表达载体,考察活性,利用接合转移转化至MP681,考察PQQ的合成。结果:扩增得到甲基营养菌MP681甲醇脱氢酶基因,在大肠杆菌中的表达产物能够催化甲醇脱氢;将携带mdh基因的质粒转入MP681后,PQQ产量略有提高。结论:获得编码MDH的基因,该基因能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有生物活性;甲醇脱氢酶基因表达对宿主菌的PQQ合成可能有一定影响。     

甲基营养菌MP681基因组测序文库的构建

目的:建立甲基营养菌MP681基因组文库,用于鸟枪法测序。方法:提取MP681基因组DNA,经超声随机片段化及T4 DNA聚合酶末端修平处理后,与经SmaⅠ酶切、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化处理的pUC19载体连接,电击转化大肠杆菌DH5α感受态,并通过末端双向测序对文库质量进行评价。结果:分别构建了2～4 kb和4～6 kb基因组文库,电泳结果显示插入片段长度与预期符合,文库库容均在10万以上。结论:构建了插入片段大小和库容符合要求的甲基营养菌MP681全基因组鸟枪法2～4 kb、4～6 kb测序文库。     

适应性驯化选育高产吡咯喹啉醌的生丝微菌突变株

吡咯喹啉醌(PQQ)广泛存在于生物体内,具有促进机体生长、维护线粒体功能、促进神经生长因子合成和调节机体自由基水平等生理功能,在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。为提高脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans FJNU-6的PQQ生产性能,文中以高浓度甲醇为拮抗因子进行实验室适应性定向驯化,通过光谱法快速筛选体系,选育PQQ高产正突变株。6轮适应性驯化后,每轮驯化的正向突变率达到90%以上,产量提高1倍的突变株达到10%左右。最后,利用5L发酵罐对突变株FJNU-R8进行分批补料培养,相较于出发菌株,突变株在不同甲醇浓度下pqq和moxF基因簇的表达量较高且差异较小,甲醇消耗和生长速度较慢,PQQ产量达到1 087 mg/L (143 h),单位细胞产量提高了1.42倍,展现出良好的工业应用潜力。文中所述的适应性定向驯化结合快速筛选体系能简单、快速地获得高产PQQ的生丝微菌突变菌株,对其他甲基营养菌高产PQQ突变株的高通量筛选具有借鉴作用。     

酮基合酶AlpRQ影响醌那霉素的产量

[背景]角蒽环类聚酮化合物醌那霉素生物合成基因簇包含了两套酮基合酶（KS_α和KS_β）的编码基因,即alpA,alpB和alpR,alpQ,AlpA和AlpB被证明是醌那霉素合成过程中必需的酮基合酶,而AlpR和AlpQ则被认为与别的化合物的合成相关。[目的] 鉴于alpR和alpQ和必需基因alpS在醌那霉素合成基因簇上紧密相邻,本研究旨在确定它们与醌那霉素生物合成的相关性。[方法] PCR-targeting在细菌人工染色体（BAC）文库质粒上进行多基因敲除,构建好的文库质粒再导入通用宿主Streptomyces albus J1074中进行异源表达,并用高效液相色谱（HPLC）检测突变株和野生型菌株的发酵产物。[结果] AlpR和AlpQ对醌那霉素的合成没有直接影响,但是敲除AlpRQ突变株的发酵液中醌那霉素的产量显著提高了。[结论] AlpR和AlpQ很有可能是另一II型聚酮化合物的KS_α和KS_β,它们与AlpA和AlpB竞争共同的合成前体。本研究还证明了AlpR和AlpQ并不能替代AlpA和AlpB的功能。