短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及抗血小板聚集作用

目的研究短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及其抗血小板聚集作用。方法磷脂酶A2的分离纯化采用CM-SephadexC-25、DEAE-SepharoseCL-6B、SephacrylS-200、SephadexG-75柱层析法,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其蛋白分子质量,以磷脂酶Az测定方法测定其酶活性,用比浊法测定其对二磷酸腺苷（ADP）引起的血小板聚集的影响。结果从短尾蝮蛇毒中纯化所得磷脂酶A2的相对分子质量为16．0×10^3（非还原）、17．6×10^3（还原）,它具有磷脂酶A2活性,能明显抑制ADP引起的血小板聚集并呈剂量-效应关系。结论此方法成功地从短尾蝮蛇毒中分离纯化出磷脂酶A2,并能抑制血小板聚集。     

蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性,该蛋白序列特殊,难以重组制备,在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列,构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化,发现以0.5mmol/LIPTG在20℃诱导24h可获得最高表达,SDS-PAGE结果显示,SUMO-CVN为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的28%;经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明,重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明,重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性;这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。     

大孔树脂纯化卫矛总黄酮的工艺研究

筛选纯化卫矛总黄酮的最佳大孔树脂及其最佳工艺条件,采用正交设计法考察树脂种类、洗脱液浓度、pH值等因素对纯化的影响。用紫外分光光度法测定总黄酮的含量,计算吸附量、解吸率和浸膏总黄酮含量,最后确定最佳工艺条件。AB-8树脂最适于纯化卫矛总黄酮;最佳吸附量和解吸率分别是7.32 mg·g^-1和90.98%;浸膏的总黄酮含量从7.64%提高到了52.12%。该树脂可以用于精制卫矛总黄酮,提高提取物中总黄酮的含量。     

一株芽孢杆菌胞外多糖的分离纯化及其抗氧化性测定

基于实验室从新疆罗布泊沙漠筛选到一株芽孢杆菌, 研究了该菌胞外多糖的分离纯化工艺及其抗氧化性质。发酵液经离心, 抽滤等预处理后, 使用Sevag试剂除蛋白, 并以无水乙醇作提取溶剂, 通过正交实验确定最佳提取条件为: pH为7.0, 温度为4°C, 时间为1.5 h, 料液比为1:4。粗多糖溶解后上活性炭柱(1.5 cm ′ 24 cm), 用蒸馏水、60%乙醇及95%乙醇洗脱, 分离得到主要部分, 再经Sephadex G-100凝胶柱, 用0.2 mol/L的NaCl溶液洗脱, 硫酸苯酚法和考马斯亮蓝     

羊Ⅲ型前胶原的分离纯化

目的：从山羊胎皮提纯羊Ⅲ型前胶原,以代替人Ⅲ型前胶原生产免疫试剂。方法;以山羊胎皮为原料,通过11．2％硫酸铵及10％氯化钠盐析和超速离心,DE32和DE52阴离子交换纤维素柱层析提取纯化得到羊Ⅲ型前胶原。结果：测得羊Ⅲ型前胶原分子量为468kDa。主要成分甘氨酸,羟脯氨酸和脯氨酸构成比分别为40．4％,11．7％和11．1％。与人羊Ⅲ型前胶原的交叉反应为65．89％。结论：提纯得到的羊Ⅲ型前胶原可以用于代替人Ⅲ型前胶原生产免疫检测试剂。     

风疹病毒衣壳蛋白与宿主细胞相互作用蛋白的初步筛选及分析

风疹病毒(Rubella virus,RV)的衣壳蛋白(Capsid protein,CP)不仅是病毒颗粒的重要组成部分,而且还可以通过与宿主蛋白之间的相互作用来调控病毒的转录和复制.为了系统研究衣壳蛋白与宿主蛋白之间的相互作用关系,我们从RV基因组中克隆获得衣壳蛋白基因序列,将该序列导入含有eXact-6His串联亲和纯化标签的慢病毒表达载体中,并构建了稳定表达eXact-6His-Capsid融合蛋白的293T细胞系.通过eXact和6His标签的两次亲和纯化获得衣壳蛋白相互作用蛋白复合物,质谱检测并筛选后发现22个可能与衣壳蛋白相互作用的宿主蛋白.随后构建衣壳蛋白的相互作用网络并进行功能学分析,发现其相互作用蛋白主要参与病毒感染、RNA剪切、细胞凋亡及酶相关通路等过程.     

一种简单、快速、量大的辛酸纯化单克隆抗体法

用国产辛酸从BALB/C鼠腹水中纯化单克隆抗体,该法有简单、快速和经济等优点。pH 3.6—4.6不影响单克隆抗体的纯度,最小辛酸用量为22μl/ml腹水,且以加辛酸之后再加硫酸铵二步法为佳。     

鸡腿菇子实体多糖的分离纯化、理化性质及抗氧化活性

本研究对水溶醇沉法提取的鸡腿菇粗多糖脱蛋白方法进行了比较,最终确定Sevage法为最优的脱蛋白方法。经DEAE-纤维素52离子交换及Sephadex G-200分子层析柱分级、纯化,最终得到2个主要的多糖组分Ccp-I-A和Ccp-I-B。理化性质测定结果表明,二者均为白色絮状固体,能溶于水,不溶于无水乙醇、丙酮等有机溶剂;与斐林试剂,CTAB、硫酸-咔唑、碘-碘化钾及三氯化铁反应均为阴性。GC测定结果可知Ccp-I-A主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为2.03∶9.52∶1;Ccp-I-B主要由岩藻糖和半乳糖组成,其摩尔比为1∶5.21。另外,Ccp-I-A和Ccp-I-B对DPPH和·OH显示出良好的清除能力,而且,相比于Ccp-I-B,Ccp-I-A的清除能力更高,当浓度为300μg/mL,其对DPPH和·OH的清除能力可分别达到72.1%和55.3%。     

柞蚕抗菌肽CA1的分离

应用FPLC、HPLC系统配合MALDI TOF MS等技术 ,分离得到一个以灭活的Escherichiacoli诱导产生的具有明显杀菌活性的柞蚕抗菌肽CA₁。自动蛋白质序列分析仪测定其一级结构为WNPFKELERAGSRVRDAIISAGVAVATVAQATAILK ,含有 36个氨基酸残基 ,经联机检索 ,与cecropinD有 88%的同源性 ,仅有 4个氨基酸残基的差异 ,其中铰链区第 2 1～ 2 3位氨基酸为AGV ,与已知柞蚕抗菌肽A、D铰链区AGP有所不同 ,提示抗菌肽存在多态性。     

兔病毒性出血症(暂定名)的研究 Ⅱ.病毒的分离提纯、电镜观察及核酸性质

应用氯仿处理,聚乙二醇沉淀,差速及蔗糖梯度离心,可以获得部份提纯的兔病毒性出血症病毒制剂,制剂呈典型的病毒核蛋白紫外吸收曲线,最高吸收值在260nm,A260/280=1.3,电镜下病毒呈廿面体,大小约36nm,无外膜,用该制剂回接健康兔,能引起典型发病及死亡,用核糖核酸及脱氧核糖核酸酶处理,证明病毒核酸为DNA,病毒DNA的温度熔解曲线测定证明,DNA为双链,初步测定DNA的分子量约为13-15×10~(?)道尔顿。