抗siRNA的GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定细胞系的构建

目的:构建GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法:设计Polo样激酶1(Plk1)si RNA序列及相对应的同义突变引物,并利用二次PCR方法扩增Plk1基因,定向克隆到p Rex-EGFP-IRES-Hygro载体中,构建p Rex-EGFP-r Plk1-IRES-Hygro表达载体;利用逆转录病毒感染的方法,构建He La/GFP-r Plk1稳定细胞系;利用免疫印迹及激光共聚焦显微镜,验证Plk1 si RNA的干扰效果及稳定细胞系的构建。结果:双酶切鉴定和测序结果表明构建的p Rex-EGFP-r Plk1-IRES-Hygro正确;免疫印迹实验证明Plk1 si RNA序列可以有效抑制He La/GFP-r Plk1细胞中内源性Plk1蛋白的表达,但不能干扰掉外源GFP-r Plk1蛋白;在荧光共聚焦显微镜下,观察到有丝分裂的前中期和末期,GFP-r Plk1分别定位于着丝粒和中间体上。结论:构建了Plk1同义突变表达载体p Rex-EGFP-r Plk1-IRES-Hygro和He La/GFP-r Plk1稳定细胞系,为下一步研究Plk1在有丝分裂期的调控机制提供了模型。     

地黄SCoT分子标记体系的建立和指纹图谱的构建

该研究采用L_(25)(5~6)正交设计和单因素两种方法,对影响地黄SCoT-PCR反应的5个因素(模板DNA浓度,引物浓度,ddH_2O和Mix的用量以及退火温度)进行了优化。结果表明:优化后的反应体系总体积为25μL,含有8μL ddH_2O,1μL模板DNA(80 ng·μL~(-1)),1μL引物(8μmol·L~(-1))和15μL Mix,退火温度为45℃。运用30份地黄种质材料,对优化的SCoT-PCR正交体系进行多次重复验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,证明该反应体系稳定可靠。利用该体系对32条SCoT引物进行两次筛选,得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用SCoT_4等5条引物构建了上述地黄2个种共30份种质的SCoT指纹图谱。利用这5个SCoT引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。这表明SCoT分子标记体系适用于地黄主要品种亲缘关系及遗传多样性的研究,所构建的指纹图谱也为地黄常见的7个栽培品种的区分提供参考依据。     

果蝇Drosophila saltans种亚组(双翅目:果蝇科)系统发育关系:形态学能否解决分子冲突?(英文)

正确的系统发生重建对于理解进化事件至关重要。尽管分子系统学对于解决此类问题取得了极大的成功,由于一些诸如密码子使用偏性等的内在约束,来源于DNA的信息可能仍然存在着局限。因为发生在祖先的替代性转换,果蝇Drosophila saltans 5个种亚组由不同基因构建的分子系统树之间存在着冲突（在以往发表的分子系统学研究中,这些种组的每一个种亚组至少有一个代表）。本文用40个形态学特征重新分析了这些种组。不同于以前发表的大多数假说,本研究支序分类学的结果表明,果蝇sturtevanti种亚组是一个较早的分支, 而剩下的4个亚组形成一个支持度较高的类群;后者又可以再分为两个姐妹群：一个包含cordata 和elliptica 亚组,另一个包含parasaltans和saltans亚组。本研究结果修正了果蝇saltans种组的分子进化（密码子使用偏性）,并强调形态学对于系统发生重建和理解分子进化现象的重要作用。     

细菌中的独行侠

它在细胞质中穿棱留下一条长长的聚合肌动蛋白尾巴,变化一下RNA结构便能激活大量的毒力因子？并将RNA转录物的密码子隐藏在错误的DNA链上,利斯塔氏菌谱写着自己的生存法则。     

转译起始密码子周边序列的改变对Δ6-脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

将少根根霉中Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)的起始密码子周边序列作适当的修改,并把修改后获得的片段(RAD6_1)亚克隆到表达载体pYES2.0,构建重组表达载体pYRAD6_1。经测序验证,把pYRAD6_1转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达分析,同时以空载体pYES20和出发序列所构建的pYRAD6作为对照。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC_MS)分析表明,在pYRAD6和pYRAD6_1转化的酿酒酵母中生成γ_亚麻酸,而pYES2.0中没有检测到。其中,pYRAD6-1转化的酿酒酵母γ_亚麻酸表达量占细胞总脂肪酸含量的5.23%,而对照pYRAD6转化的酿酒酵母中表达量只占2.64%。     

HIV gag基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响

目的:了解gag基因修饰前后在不同载体系统中的表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Gag靶抗原奠定实验基础。方法:将含有优化前后gag基因的HIV-1 DNA(pVRC)疫苗和重组痘苗病毒(rVV)载体疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN-γ酶联免疫斑点法和胞内细胞因子染色检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Gag诱发的免疫效果。结果:DNA疫苗中gag基因修饰后细胞免疫反应由472提高至925 SFC/106MNC,抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由104.2提高至105.3,三针后则没有差别;而以rVV为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应(~320 SFC/106MNC)和抗体水平(~104.4)均没有差异。2种疫苗联合免疫均可显著提高Gag修饰前后在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由1700提高至2100 SFC/106MNC,抗体水平则没有差别。结论:gag基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对rVV疫苗单独免疫效果无明显影响。     

人乳头瘤病毒(HPV)58型DNA疫苗免疫原性的初步分析

为了检测HPV 58型不同L1基因的DNA疫苗的免疫原性,以pcDNA3.1为载体分别构建含HFV 58型不同L1基因的DNA疫苗,命名为L1h、L1h△c、L1S、L1SM和L1wt.用免疫印迹法检测各DNA疫苗的体外表达情况;各重组质粒与pcDNA3.1-h58L2和pcDNA3.1-GFP共转染293FT细胞,检测其形成假病毒的能力;并将各DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠,利用假病毒中和实验检测中和抗体水平,用ELISPOT检测细胞免疫情况.结果显示,本实验成功构建了五种DNA疫苗,L1h△c的体外表达量最高,L1S和L1SM的表达量次之,L1wt没有表达;重组质粒L1S能够形成假病毒,而其他四种重组质粒均不能形成假病毒.L1S和L1h均可在小鼠体内诱导中和抗体,但L1S诱导的中和抗体的平均滴度为1:6 400,明显高于L1h诱导的中和抗体水平(平均滴度为1:48),而其他疫苗在小鼠体内未产生中和抗体.对五种疫苗均未检测出特异性的细胞免疫反应.结果提示,体外能够组装成假病毒的DNA疫苗在免疫动物后可诱导高滴度的中和抗体,为今后DNA疫苗的筛选提供参考.     

寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析

根据寄生曲霉脂肪酶基因序列(GenBank登录号:AF404488)及大肠杆菌密码子的偏爱性,应用重叠延伸PCR技术,人工合成了寄生曲霉脂肪酶基因lipAP.将基因克隆到pFL-B13cl载体上获得重组质粒pFL-B13cl/Lip AP,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达.融合蛋白Sumo-LipAP在0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导6 h表达量最高.SDS-PAGE分析显示融合蛋白His-Sumo-LipAP以包涵体形式表达,大小约为53 kD.复性后透析处理,大部分融合蛋白转化为正确构象且具有催化活性,经一步疏水层析其纯度可达98％.生物信息学工具预测和分析发现,LipAP空间结构保守,具有催化三联体(Ser173-Asp226-His288)、活性部位盖子(S111YSIRNWVTDAT122)及保守五肽(GHSLG)3个功能域.     

遗传密码的高维空间对称性

对称性是由均衡比例产生的匀称美。对称性和对称破缺在自然界和生命现象中普遍存在。20种氨基酸和终止码共有64个遗传密码子,组成一个6维的编码空间。遗传密码空间以对称轴将空间分成对称的两大部分：嘌呤空间和嘧啶空间。遗传密码子的简并以对称轴为参考轴,呈平行排列。高简并度氨基酸（6,4,3,简并度）和低筒并度氨基酸（1,2简并度）的简并子空间近似呈周期性的双方错方式排列。遗传密码的简并与4种核苷酸的二进制数字编码,具有密切的关系。经过分析,可得出遗传密码的连通性λλ简并法则：“除丝氨酸的密码子分成两个与对称轴平行的,分离的子空间之外,其余氨基酸和终止密码的密码子,都通过与空间对称轴平行的λλ平面或λ边简并,组成独立的,单一的连通子空间。”并对氨基酸密码子的惯用率与编码空间的对称关系,以及数字生物学的意义进行了分析和讨论。     

利用ARIMA模型对木聚糖酶F/10和G/11的进化过程分析

目的:利用ARIMA模型对木聚糖酶(Xylanase)F/10和G/11家族的进化过程进行分析,并分析两家族中同时含量较高的氨基酸在进化中的特征.方法:计算出每条序列中均含量较高的几种氨基酸,利用SAS时间序列中的ARIMA模型,选取木聚糖酶F/10和G/11两个家族的各十条进化阶段不同的序列,设计一个时间序列实验进行分析.结果:F/10家族的进化是平稳的,甘氨酸含量逐渐降至7%左右,缬氨酸的含量稳定的保持在7%上下,而G/11家族的进化存在较大波动,甘氨酸含量升至14%左右,丙氨酸含量相对于F/10家族稳定.结论:F/10家族的进化比G/11家族稳定,甘氨酸在两家族进化存在明显差异,这对研究木聚糖酶分子的进化以及同义密码子的偏好性具有一定的指导意义.