应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

全反式维甲酸对急性早幼粒细胞白血病患者血清学的影响

目的：探讨全反式维甲酸（All trans retinoic acid,ATRA）作为辅助剂在急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia, APL）治疗中,对患者血清促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）、血清铁蛋白、叶酸和维生素B12水平的影响。方法：回顾性分析 我院2011 年6 月-2015 年6 月接诊的50 例急性早幼粒细胞白血病患者的临床资料。根据患者的治疗方法不同将患者分为两组, A 组（亚砷酸钠治疗组）和B 组（亚砷酸钠联合ATRA）。对比两组患者治疗后血清铁蛋白、EPO、叶酸和维生素B12 恢复情况。结 果：两组患者入院时所有血清EPO、铁蛋白等比较,差异无统计学意义（P>0.05）;治疗后两组患者血清各指标均有所改善（P<0. 05）;治疗后B 组患者中EPO、血清B12、血清铁蛋白和叶酸恢复正常水平者明显多于A 组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论： 全反式维甲酸辅助治疗急性早幼粒细胞白血病患者能够更好的改善患者血清EPO、铁蛋白、叶酸和维生素B12 的异常,对于疾病 的治疗有一定的效果。     

叶黄素与叶酸的研究

叶黄素（Lutein）又名植物黄体素,分子式C40H50O2,易溶于氯仿、CO2,微溶于醇、醚,被认为是维生素的一个新品种。在复合维生素中加入一定比例的叶黄素对人体的保健起着重要作用。特别是在抗视力疲劳方面显现出一定的功效。在人的视网膜中除了特有的视紫红质（rhodopsin）之外,还含有叶黄素,一旦缺乏叶黄素必将引起视黄斑退化,损害视力,其致病机理和缺乏维生素A引起夜盲症类似。在美国,65岁以上的老人视黄斑退化占10％以上。除此之外,叶黄素在防病、抗癌和增强免疫力方面的作用也不可小视。它是人血液中主要类胡萝b素之一,对直肠癌、皮肤癌等多种癌症有抑制作用,例如它可保护皮肤不受紫外线照射的损伤,能大大减少皮肤癌的发生率,机体免疫力增强了。在膳食中摄入叶黄素不仅可以抑制肿瘤,还能预防肿瘤的发生。叶黄素还有利于预防心血管病的发生,延缓早期动脉硬化。这些充分显示了叶黄素对人体保健方面的重要价值。     

叶酸受体基因转染细胞诱导后的类脂改变对叶酸摄取的影响

用胆固醇合成抑制剂Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ（洛伐他汀,暂译名）和神经鞘脂类合成抑制剂ＦｕｍｏｎｉｓｉｎＢ１（抑鞘脂素Ｂ１,暂译名）处理能表达糖基化磷脂酰肌醇锚定叶酸受体（ＧＰＩＦＲ）的基因转染细胞（ＦＲα·ＴＲＶＢ－１）３ｄ,发现前者可使细胞的胆固醇含量减少约３５％,而后者可使神经鞘脂类减少４４％以上;同时发现,处理组细胞结合叶酸的能力减少约４０％,其对５－甲基四氢叶酸的摄入率减少逾８０％．这主要是由于细胞质膜中胆固醇和神经鞘脂类含量减少,从而导致膜内ＧＰＩＦＲ结合叶酸功能降低及ＧＰＩＦＲ摄入叶酸的内化过程障碍所致．其详细作用机制尚待进一步研究     

叶酸-阿霉素连接物的制备及其抗肿瘤活性研究

目的:合成具有酸敏特性的叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物,并观察其抗肿瘤活性以及对肿瘤细胞的靶向性.方法:首先将叶酸与氨基己酸连接,然后利用腙键与阿霉素连接,采用核磁共振、质谱等方法鉴定其结构;采用MTT法观察连接物对叶酸受体袁达阳性的口腔表皮样癌细胞KB细胞及叶酸受体表达阴性肺癌A549细胞的毒性作用.结果:在氮羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺的催化作用下,合成了叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物,波谱分析提示为目标产物.与游离阿霉素相比,连接物对KB细胞具有更强的细胞毒性,而且细胞毒性作用可被外源性叶酸抑制;而连接物对A549细胞的毒性弱于游离阿霉素,而且外源性游离叶酸对其细胞毒性没有显著影响.结论:叶酸-氨基己酸-阿霉素连接物能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞,是一种潜在的新型抗肿瘤药物.     

十种一碳代谢关键产物的HPLC-MS/MS 定量检测方法

目的:利用HPLC-MS/MS方法对十种一碳代谢相关产物进行定量分析。方法:采用Aglient ZORBAX SB-AQ C18柱(2.1mm×100 mm,3.5 m)、电喷雾离子源(ESI),以多离子反应监测方式(MRM)进行正离子检测。对游离叶酸(FA)、5-甲酰四氢叶酸(5-FT)、5-甲基四氢叶酸(5-MT)、S-腺苷蛋氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、胱硫醚(CYSTA)、组氨酸(HIS)、丝氨酸(SER)、蛋氨酸(MET)、同型半胱氨酸(HCY)进行定量分析。结果:FA、5-FT、5-MT、SAM、SAH、CYSTA、HIS、SER、MET、HCY的检测限分别为0.1 ng.L-1、0.25 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.25 ng.L-1、0.25 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.025 ng.L-1、0.1 ng.L-1、0.1 ng.L-1。FA、5-FT、5-MT、SAH、CYSTA浓度测定方法线性范围为2~50 ng.L-1,SER、SAM浓度测定方法线性范围20~500 ng.L-1,MET、HCY浓度测定方法线性范围200~5000 ng.L-1,HIS浓度测定方法线性范围为400~10000 ng.L-1,r均在0.993以上,全部涵盖了已报道的血清中指标的含量范围。结论:建立了HPLC-MS/MS方法,可同时分析十种一碳代谢通路的关键产物,所需样品量少,检测速度快,同时实现分项检测,可为多种代谢性疾病系统性地检测一碳代谢中间产物体液分析方法建立实验条件基础。     

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T、G1793A 单核苷酸多态性 与散发性乳腺癌易感性的关系

目的:研究亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T、G1793A位点单核苷酸多态性与散发性乳腺癌易感性关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,对200例乳腺癌患者及200例正常对照者MTHFR基因C677T、G1793A位点单核苷酸多态性进行分析,logistic回归分析不同基因型与乳腺癌风险的关系。结果:乳腺癌组MTHFR 677TT基因型频率为25.00%显著高于正常对照组的10.50%(X2=14.401,P=0.001),CT基因型频率为44.50%低于正常对照组的54.50%,CC基因型频率在乳腺癌组和正常对照组中无差别;MTHFR 1793GA基因型频率为18.50%显著高于正常对照者的8.50%(X2=8.563,P=0.003)。乳腺癌患者MTHFR 677T和1793A等位基因频率分别为47.25%、9.25%,显著高于对照组中的37.75%、4.25%。MTHFR 677TT基因型携带者罹患乳腺癌的风险是677CC基因型携带者的2.732倍(95%CI=1.418～5.051,P=0.001),MTHFR1793GA基因型携带者罹患乳腺癌的风险是1793GG基因型携带者的2.444倍(95%CI=1.325～4.505,P=0.003)。另外,乳腺癌组中MTHFR C677T基因多态性与肿瘤大小相关(x2=7.431,P=0.024,MTHFR G1793A基因多态性与淋巴结转移情况(x2=8.939,P=0.011)、癌组织学分级(x2=9.983,P=0.007)相关。结论:MTHFR C677T、G1793A基因多态性与散发性乳腺癌的易感性相关。     

常用抗癫痫药对癫痫患者血同型半胱氨酸的影响

目的:观察常用抗癫痫药对癫痫患者血同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12浓度的影响。方法:比较45例服用单药治疗的癫痫患者(服用卡马西平11例,服用拉莫三嗪12例,服用奥卡西平9例,服用丙戊酸13例)血同型半胱氨酸、叶酸、维生素B12浓度的差异。结果:癫痫患者血同型半胱氨酸均高于正常,而叶酸和维生素B12均在正常范围内;服用拉莫三嗪的患者其血中同型半胱氨酸低于服用丙戊酸、卡马西平和奥卡西平的患者;服用卡马西平的患者血中叶酸高于服用拉莫三嗪、丙戊酸的患者(P<0.05);维生素B12在各用药组间无统计学差异。结论:长期服用抗癫痫药物可引起血中同型半胱氨酸的升高,而高同型半胱氨酸血症可增加心脑血管疾病的危险,故癫痫患者应常规给予补充叶酸、维生素B12,以使血同型半胱氨酸水平恢复正常。     

两种微生物法测定食品中叶酸含量的比较

比较酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei,L.casei ATCC 7469)、粪链球菌(Streptococcus faecalis,S.aecalisATCC 8043)测定强化食品中叶酸的含量,结果表明,S.faecalis比L.casei检测时限短1d,实验操作容易把握,分别对两种菌检测结果重现性进行比较,P＞0.05,差异无统计学意义,两种方法实验结果比较,P＞0.05,差异无统计学意义.     

血浆同型半胱氨酸水平与轻度认知功能障碍的相关性分析

目的:探讨轻度认知功能障碍(MCI)与血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的关系。方法:测定96例MCI及85例健康体检者得血浆Hcy、叶酸及维生素B12水平;MCI患者中选择高Hcy血症者62例,按照是否接受叶酸、维生素B12治疗随机分为治疗组和非治疗组,观察治疗前后Hcy水平及MMSE评分变化。结果:MCI组血浆Hcy水平显著高于对照组(P<0.05),叶酸、维生素B12及MMSE评分低于对照组(P<0.05);MCI组中Hcy水平与叶酸、维生素B12及MMSE评分均呈负相关(P<0.05);治疗后治疗组Hcy水平较治疗前显著下降(P<0.05);治疗组Hcy低于非治疗组(P<0.05);治疗组MMSE评分较治疗前升高,但无显著性差异(P>0.05),治疗组MMSE评分与非治疗组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:血浆Hcy升高是MCI的重要因素,补充叶酸、维生素B12可降低血浆Hcy水平。