光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

光裸星虫ISSR-PCR反应体系的单因素优化试验

以光裸星虫为试验材料,通过单因素方法对影响其ISSR-PCR扩增效果的因子(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、甲酰胺和二甲基亚砜)浓度进行研究。确立适合光裸星虫ISSR-PCR的反应体系:25μL体积含1×PCR buff-er、模板DNA用量为10-50 ng、TaqDNA聚合酶为0.75-1.75 U、Mg2+浓度为1.5-2.5 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.8-1.2μmol/L,甲酰胺和二甲基亚砜的添加并不能优化光裸星虫ISSR-PCR反应结果。利用所建立的体系对广西北海群体的20个光裸星虫个体基因组DNA进行ISSR-PCR扫描,结果表明,优化后的体系均能扩增出清晰、多态性高的条带。     

光裸方格星虫野生与养殖群体线粒体控制区序列的遗传差异分析

基于线粒体控制区序列对光裸方格星虫（Sipunculus nudus Linnaeus,1766）的2个养殖群体（营盘YP、竹林ZL）和4个野生群体（防城港FC、钦州QZ、大冠沙DG和越南海防YN）的91个个体进行遗传差异分析,研究光裸方格星虫养殖和野生群体的遗传变异情况。结果显示:获得的514 bp DNA序列中,野生与养殖群体的多态性位点数分别为82和60,均显示出对AT的偏倚性。共定义85个单倍型,共享单倍型4个,其中共享单倍型Hap5为原始单倍型,营盘群体均为独享单倍型。各群体的单倍型多样性（H_d）相同,野生群体的平均核苷酸多样性（P_i）（0.01531）略高于养殖群体（0.01514）,6个群体的遗传多样性水平依次为YN > YP > QZ > FC > ZL > DG。各群体间的遗传分化并不显著（P>0.05）,光裸方格星虫的遗传变异主要来自群体内个体间（99.08%）,同时未发现明显的地理谱系结构。研究表明,光裸方格星虫野生群体的遗传多样性水平总体略高于养殖群体;滩涂底播养殖方式较池塘养殖更利于维持光裸方格星虫遗传多样性;各群体间不存在显著的遗传分化,养殖群体正逐渐积累遗传变异,但尚未足够以形成其独立的遗传结构。     

可口革囊星虫受精过程及早期卵裂的细胞学变化

为探究可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)受精过程中精子入卵、极体排放、雌雄原核的形成与结合以及早期卵裂的特点,为胚胎发育机制研究奠定基础及指导人工育苗,显微观察了可口革囊星虫卵母细胞的形态;用荧光染色剂HOECHST33258对已固定的成熟卵及受精卵进行染色的方法,在荧光显微镜下观察了可口革囊星虫受精过程及第一与第二次卵裂的细胞学变化。成熟卵呈椭圆形,卵膜较厚,核区偏位,染色体排列整齐。在水温30℃-31℃、盐度23条件下,授精后5min-10min,精子完成入卵;授精后10min-20min,完成第一次减数分裂、释放第一极体;授精后20min-30min,完成第二次减数分裂、放出第二极体,部分受精卵的第一极体分裂为二;授精后30min-40min,雌、雄原核形成,并相互靠近向卵中央迁移;授精后40min-50min,雌、雄原核在卵中央结合成合子核;授精后50min-70min及70min-90min分别完成第一及第二次卵裂。可口革囊星虫的受精过程及早期卵裂的细胞学特点为:1)成熟卵是处在第一次减数分裂中期的初级卵母细胞,具有受精能力;2)精子入卵位点是随机的,存在多精入卵现象;3)雌、雄原核以融合方式结合成合子核;4)第一及第二次卵裂均为经裂、不等裂。