静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.     

家蝇变形期抗菌蛋白的提取

目的:分离纯化家蝇变形期体内抗菌蛋白并分析其抑菌作用。方法:对家蝇（Ｍusca domestica）5日龄幼虫进行针刺诱导,并于24h后挑取变形后的蛹,通过研磨、调酸、加热提取蛹体内的耐热水溶总蛋白,经过两步CM sepharose F.F.离子交换层析分离,以金黄色葡萄球菌作指示菌,检测其抑菌活性,并用SDS PAGE不连续电泳检测蛋白质的分子量。结果:经两步离子交换分离后,得到一种对金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的蛋白,经SDS PAGE检测为单一条带,其分子量为43kDa。结论:家蝇处于变形期时,经过诱导后体内能产生一种抑菌活力较强的蛋白质。     

HBV感染者肝纤维化四项指标检测值与Fibroscan检测值的相关性分析

目的分析HBV感染者四项肝纤维化血清学指标检测值与Fibroscan检测值之间的相关性。方法选择大连市第六人民医院211例HBV感染者,按肝影像学Fibroscan检测值将患者分为肝硬化组和非肝硬化组,非肝硬化组患者再根据Fibroscan分期分为无肝纤维化组、轻度肝纤维化组、中度肝纤维化组和重度肝纤维化组。所有患者均采集其相近时间内Fibroscan及Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)检测数据。结果运用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果 PCⅢ、C-Ⅳ、HA、LN检测值与Fibroscan检测值之间均具有良好的相关性(r=0.404、0.445、0.557、0.470,P0.01),其中以HA检测值与Fibroscan检测值之间的相关性最高(r=0.557,P0.01)。结论肝纤维化四项血清学指标检测值与Fibroscan检测值之间相关性显著。肝纤维化四项血清学指标检测在肝纤维化程度较重时的准确性更高。     

家兔精子膜蛋白rsp10基因的克隆和特征分析

 sp10基因在精卵识别过程中起着重要作用 .从家兔睾丸cDNA文库中克隆了家兔的sp10基因 (rsp10 ) ,cDNA序列全长 12 82bp ,包含 10 0 5bp开放阅读框 .由开放阅读框推测出的氨基酸序列与人、狒狒、狐和小鼠的SP10氨基酸序列之间存在较高水平的同源性 ,同源性分别为 70 %、69%、68%和 61% .在大肠杆菌中表达rsp10基因 ,获得重组rSP10 .用重组rSP10免疫雌性母兔 ,得到rSP10专一性多抗 .对精子膜蛋白进行免疫印迹分析发现 ,rsp10基因在家兔睾丸中的表达呈现多态性 .rsp10基因在GenBank的登录号为 :AF2 51558.     

APRT缺陷型CHO细胞系的建立及其重组蛋白表达能力评价北大核心CSCD

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因,验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性;构建两种真核表达载体:对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP),分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池;重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度,并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明,CHO细胞aprt基因成功敲除;获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明,与野生型CHO细胞相比,转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%;特别是长期传代培养时,转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P<0.05);构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。     

肺炎链球菌毒力基因体内荧光报告系统的构建*

以绿色荧光蛋白(GFP)作为体内研究的分子探针,将肺炎链球菌毒力基因与gfp融合构建肺炎链球菌自杀性荧光报告质粒,利用同源重组的原理,使gfp整合入肺炎链球菌基因组中,建立体内研究肺炎链球菌基因表达的荧光报告系统,并用荧光激发、生物学特征和生理活性测定等实验手段进行评价,证实这一肺炎链球菌荧光融合表达系统可在体内外报告肺炎链球菌的毒力基因表达,为进一步在体内分析和鉴定肺炎链球菌毒力因子的功能奠定基础。     

0.5 μg(kg·h)维持剂量右美托咪定麻醉对肺癌根治术患者血清IL-6、NSE、S100β蛋白水平的影响

目的:探讨肺癌根治术应用0.5μg(kg·h)维持剂量右美托咪定(Dex)辅助麻醉对患者血清白细胞介素-6(IL-6)、神经元特异性烯醇化酶(NES)及S100β蛋白水平的影响。方法:选取我院2016年3月~2017年3月收治并择期行肺癌根治术治疗的92例患者,采取随机数字表法均分为两组。所有患者均采取相同的常规静吸复合麻醉,于麻醉诱导前15 min(T_1)静脉滴注负荷剂量为1μg/kg的Dex。观察组在此基础上以0.5μg/(kg·h)速度持续静脉泵注Dex至术毕前10 min,对照组以等剂量生理盐水重复以上操作。记录比较两组T_1、单肺通气前(T_2)、单肺通气60 min(T_3)、术毕时刻(T_4)、术后24 h(T_5)血清IL-6、NSE、S100β蛋白水平及术后不良反应的发生情况。结果:与T_1时间点对比,两组T_2、T_3、T_4、T_5时血清IL-6、NSE、S100β水平均显著升高(P0.01),且观察组在T_2、T_3、T_4、T_5时血清IL-6、S100β水平显著低于对照组同时(P0.01)。观察组术后不良反应率较对照组低(P0.05)。结论:肺癌根治术应用0.5μg(kg·h)维持剂量右美托咪定(Dex)辅助麻醉更能有效降低术患者IL-6、NSE、S100β蛋白水平,抑制机体炎症反应,减轻脑损伤,且安全性高。     

表达马传染性贫血病毒受体和荧光素酶报告基因的293细胞系的建立

为了在体外精确、简便地测定马传染性贫血病毒(EIAV)的中和抗体和研究不同毒株与受体的亲和性,克隆了马慢病毒受体1(ELR1)cDNA并插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建了表达载体pELR1。该载体瞬时转染293细胞后,经Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测,确认了ELR1的表达。在pELR1质粒的基础上,插入EIAV疫苗株前病毒基因组转录调控区LTR以及萤火虫荧光素酶报告基因(Luc)构建了表达载体pELR1-LTR-Luc,并转染293细胞,建立了ELR1-LTR-Luc(293-E)细胞系。该细胞系能稳定表达ELR1基因,并且能在LTR的调控下表达萤火虫荧光素酶基因。用1000TCID50的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株D18V13接种该细胞,24h后检测其荧光素酶活性是未接毒对照的3.15倍。同时用IFA检测证明了病毒在细胞内的增殖。EIAV强毒株L21的接毒试验显示,ELR1-LTR(293-E)细胞的萤火虫荧光素酶活性与该毒株的接毒量在10-2~10-7稀释范围内呈正相关。该细胞系传35代后,外源基因的表达特征未发生改变。该细胞系的建立为进一步开展EIAV与细胞受体相互作用以及中和抗体评价等研究奠定了重要基础。     

白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合基因的克隆及高效表达

利用聚合酶链式反应和寡核苷酸介导的定向诱变技术构建了白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素IL2-PE40、IL2-PE40KDEL、IL2-PE66~(4Glu)和IL2-PE66~(4Glu)KDEL融合基因的原核表达重组质粒,并实现了高效表达,表达产物占菌体总可溶蛋白的20％～30％。此外,由于这一表达质粒在IL-2cDNA与PE基因连接处引入了唯一的SmaⅠ位点,其5＇、3＇端分别含有唯一的EcoRⅠ、PstⅠ位点,因此可方便地用其它基因替换IL-2或PE基因而获得相应融合蛋白的表达质粒。     

在不同物理化学条件下天花粉蛋白的圆二色性研究

用圆二色谱研究了天花粉蛋白在酸性和碱性溶液中的构象,并观察了在十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中天花粉蛋白分子构象的变化,用Chen,Yang与Martinez等人的方法计算了各种条件下天花粉蛋白二级结构含量.结果表明:在很宽广的pH范围内(从pH2到pH12)分子构象基本上是稳定的.但是,在强碱性条件下即pH>12(室温)或pH11.5(40℃)螺旋含量显著减少.在碱性条件下,于250nm附近出现一新的CD带,它的强度与离解的酪氨酸残基个数呈线性关系,说明这一新带主要是由离解的酪氨酸残基产生的.