植物基因工程的克隆载体

一、引言 长期以来,遗传学家和植物育种学家就一直努力应用常规的遗传育种手段,培育更加符合人类需要的优良的农作物新品种。特别是本世纪五十年代开始的所谓“绿色革命”。     

人脑髓鞘碱性蛋白cDNA体外扩增、克隆和鉴定

采用聚合酶链反应(PCR)从人脑cDNA文库中扩增出600bp的髓鞘碱性蛋白(MBP)cDNA片段,与载体pGEM-3Zf(+)平端连接.重组质粒DNA转化宿主菌JM109,在含X-gal和IPTG的平板上直接筛选阳性克隆.限制性内切酶分析和成套引物扩增鉴定证明,该克隆含有7个外显子的21.5kD人脑MBP全长编码序列.     

反转录病毒载体系统

反转录病毒载体系统曹虎（江苏省东海县教育局２２２３００）反转录病毒是一种ＲＮＡ病毒,由糖蛋白外壳、两条ＲＮＡ链和含有反转录酶的核心蛋白组成。当包着ＲＮＡ链的核心蛋白进入宿主细胞后。反转录酶启动,以病毒ＲＮＡ链为模板,反转录出单链ＤＮＡ,继而生成双链Ｄ...     

聚乙二醇二缩水甘油醚交联氨基载体LX-1000EA固定化脂肪酶 *

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)作为双功能环氧试剂,在实验中被用于交联氨基载体LX-1000EA共价固定化海洋脂肪酶,经过处理后的载体共价固定化脂肪酶具有良好的效果。实验经过单因素初筛和正交试验,得到最佳的交联及固定化条件为0.75%交联剂浓度、交联温度35℃、交联时间3h、载体量1.25g、pH9.0、固定化温度55℃、固定化时间1h。对LX-1000EA-PEGDGE固定化酶与游离酶、戊二醛(GA)交联LX-1000HA-GA的固定化酶进行酶学性质的比较,发现LX-1000EA- PEGDGE固定化酶较游离酶最适反应温度未改变,与LX-1000HA-GA相同的是最适反应pH都由7.0提高为8.0。在最适条件中所测LX-1000EA-PEGDGE酶活达到78.84U/g,固定化改变了游离酶的酸碱耐受性,热稳定性和操作稳定性较游离酶和LX-1000HA-GA固定化酶均有提高。LX-1000EA-PEGDGE的热稳定表现优异,在60℃孵育3h后保留90%酶活;使用5次后仍能残余50%酶活;保存30天酶活仍保留60%。首次使用新型双环氧交联剂PEGDGE交联有机氨基载体共价结合固定化脂肪酶,为更有效的固定化方法提供了技术支持,同时也发现交联剂对固定化酶的性质存在较大影响。     

链霉菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶对载体蛋白的底物选择性的研究进展

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化脂肪酸合酶(FAS)、聚酮合酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)中载体蛋白从脱辅基形态转化为全辅基形态,对脂肪酸、PKS产物和NRPS产物的生物合成起着不可或缺的作用。本文介绍并总结了链霉菌PPTase对载体蛋白底物选择性的最新研究进展:Ⅲ型PPTase特异性催化同一个多肽链中ACP的辅基化;Ⅱ型PPTase倾向于催化Ⅰ型PKS中ACP和NRPS中PCP的辅基化;Ⅰ型PPTase倾向于催化Ⅱ型PKS中ACP和Ⅱ型FAS中ACP的辅基化;编码基因位于基因簇内的Ⅰ型/Ⅱ型PPTase倾向于催化编码基因位于同基因簇内的PKS/NRPS中ACP/PCP的辅基化;这些研究结果为阐明并改造链霉菌辅基化网络以提高特定次级代谢产物的产量提供了参考和借鉴。     

单纯疱疹病毒I型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ｉ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列,与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架,构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ,其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞,ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒,这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１     

缺血引起沙土鼠纹状体DARPP—32磷酸化状态的变化

采用蒙古沙土双侧颈总动脉阻断前脑缺血模型,以放射自显影（反向磷酸化,back-phosphorylation)及免疫印迹（Western blotting)法体外测定缺血时纹状体DARPP－32磷酸化水平和蛋白含量的变化,结果表明,短暂性缺血纹状体DARPP－32的免疫学活性和蛋白含量地明显改变。在缺血10min内,随缺血时间的延长,体外DARPP－32的[^32P]的掺入量在缺血5min时升高,在缺血2,7,10min时均降低,而反向磷酸化的测定结果表明体内DARPP－32磷酸化水平增高,说明缺血可诱导DARPP－32磷酸化水平变化。     

纤维素多孔微载体的制备及其用于动物细胞培养

将纤维素铜氨溶液喷洒至-40℃的硅油：正己烷=1：4的冷冻液中形成含冰晶的微球,用-30℃、40%的H₂SO₄再生纤维素,并用EDAE盐酸盐修饰其表面,制成适合动物细胞培养的纤维素多孔微载体。利用该微载体培养能分泌尿激酶原(Pro-UK)的重组CHO细胞,在100mL搅拌瓶中换液培养25d,细胞最高密度为6.3×10⁶/mL,尿激酶原最高活性为2325IU/mL,共获28.7mg产品。之后转入1000mL搅拌瓶中培养,可观察到细胞可从种子微载体中自动转移到新微载体中生长繁殖直至所有微载体中都长有细胞。在25d二级培养中,细胞最高密度为7.3×10⁶/mL,尿激酶原最高活性为3108IU/mL,共获含353mg尿激酶原的上清13.7L。在培养后期换用无血清培养基培养,细胞生长及蛋白表达水平正常。     

过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆表达及发酵优化

利用PCR扩增技术得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶基因katA,将该基因与表达载体pET-20b(+)连接构建重组质粒,经测序验证后,在大肠杆菌JM109中进行表达得到重组大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-katA).SDS-PAGE电泳结果显示出...     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。