麻疹病毒全长cDNA构建及其感染性的研究

为发展新型疫苗和改造目前使用的麻疹病毒疫苗,以麻疹病毒疫苗株为模板,构建了具有感染性的麻疹病毒cDNA克隆.用RT-PCR分6段扩增出麻疹病毒全长基因,通过酶切、拼接构建麻疹病毒疫苗株CC-47的全长正链cDNA序列,并精确地置于T7启动子控制下与丁型肝炎病毒核酶序列之前.克隆麻疹病毒CC-47株蛋白N、P、L编码区质粒并置于T7启动子控制下,用4个质粒共转染哺乳动物细胞,在表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VTF7-3的作用下进行病毒拯救.经免疫荧光、PCR等方法检测证实,获得了具有感染性的麻疹病毒.所拯救的病毒在哺乳动物细胞连续传3代后,仍能检出病毒抗原和核酸.     

非同位素反向Northern筛选法

此文介绍了一种非同位素简单快速的反向Northern 筛选方法。采用非同位素法标记探针,操作简便,不涉及污染环境。在杂交过程中采用三次校正,结果可靠,重复性好。该方法能有效地,高通量地验证差异表达基因。Abstract: In this paper, a simple, rapid and safe method of Reverse Northern was introduced. A non-radioactive labeling system was used to label the probe. During the process, the quality of probe was normalized three times to rule out the possibility of false results. Samples were dotted as microarray and were hybridized effectively. The method is effective and expected to be widely used in laboratories.     

人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选

人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)在增殖过程中如何保持未分化状态是干细胞生物学的核心问题之一,已有的LIF通路、Oct-4因子及Nanog基因的作用还不能对这一问题做出全面的解释。为进一步了解维持hESC未分化状态的机制,采用自行建立培养的hESC及分化的hESC细胞克隆(differentiated hESC,dhESC),应用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)结合反向cDNA斑点杂交技术,筛选出在hESC高表达、在dhESC中低表达或不表达的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)共105个。通过与GenBank比较,显示其中76个EST代表61个已知基因,18个EST代表15个假想基因,另有11个属于未知EST。选取其中8个克隆进行半定量RT-PCR分析,证实其中7个克隆在hESC中高表达,在dhESC中低表达或不表达。结果表明,hESC分化前后涉及多个基因的差异表达,对这些在hESC中高表达、在dhESC中低表达或不表达基因的进一步功能研究为阐明维持hESC未分化状态的机制提供了基础。     

应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒

在国内首次应用反向遗传学技术将多个质粒共转染哺乳动物细胞,得到了具有活性的甲型流感病毒.采用自行构建的含有polⅠ和polⅡ启动子和终止子序列的pIVV2质粒,将A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基因组全部8个RNA节段的cDNA分别克隆到该质粒的两个启动子之间,得到了8个可在真核细胞中复制和表达的质粒.将这8个质粒共转染293T细胞,培养48h后吸取上清液,转接入MDCK细胞中,再经过72h培养,发现在MDCK细胞中有明显的流感样细胞病变产生,测上清病毒血凝滴度为1:10.将MDCK细胞冻融液继续接种鸡胚和MDCK细胞,培养后将鸡胚尿囊液和MDCK细胞冻融上清液进行血凝和血凝抑制实验,证明所得病毒为A/PR/8/34(H1N1).此结果将有助于国内今后对流感疫苗的研究.     

利用RNAi技术大规模分析基因功能的研究

将双链RNA导入细胞内会干扰与之同源的基因的表达,使生物体产生相应的功能缺陷表型,这种作用称为RNAi（RNA interference）。针对人类、植物、微生物等大规模基因组测序后所面临的功能鉴定难题,着重探讨了RNAi的机制及其研究进展。复合物RISC和酶Dicer的发现揭示了RNAi导致同源基因沉默的作用机理。通过使用RNAi这种反向遗传学工具可使生物体产生相应的功能缺陷表型,从而确定未知基因的功能。因此RNAi对大规模分析动、植物基因功能的研究具有重要的作用。     

利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6 0基因     

用DDRT-PCR技术克隆小鼠早期胚胎发育相关基因

mRNA差异显示 (DDRT PCR)技术在哺乳动物早期胚胎发育相关基因研究中的应用 ,因获得足够量的早期胚胎材料困难而受到限制 .通过对DDRT PCR技术各种条件参数进行优化组合 ,并对某些环节进行改良 ,以小鼠的MⅡ卵、2 细胞胚胎和 4 细胞胚胎为材料进行差异显示 ,仅以相当于5 0个卵细胞的量为起始材料 ,便得到了理想的差示结果 .从差异条带中挑取感兴趣的差异条带进行回收、阳性鉴定、亚克隆、序列分析、并在反向Northern杂交基础上设计了鉴定实验 .结果发现 ,有一个片段差异显著且是阶段性特异表达 .经GenBank检索 ,发现该片段仅有同源的EST ,其全长及功能尚不清楚 ,是一个功能未知基因 ,将该片段命名为ed1.反向Northern杂交结果表明 ,ed1在 2 细胞期胚胎中有表达 ,而在MⅡ卵及 4 细胞胚胎中均不表达 .     

植物逆境胁迫耐受性功能基因组研究进展

为了更加高效地利用基因工程技术提高植物对逆境胁迫的耐受性,需要在全基因组水平上对植物逆境胁迫耐受性的复杂机制进行整合性研究.植物逆境胁迫耐受性功能基因组的研究可概括为：利用胁迫特异性的表达序列标签(EST)及cDNA微阵列（或基因芯片）技术筛选与胁迫相关的候选基因,然后利用反向遗传学等技术对候选基因的功能进行研究,利用酵母双杂交、正向遗传学等技术对基因及基因产物间的相互关系进行研究.通过这些研究可以全面地了解植物对胁迫（渗透、干旱、极端温度）响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号转导途径,从而为更加高效地利用基因工程技术提高植物对逆境胁迫的耐受性奠定基础.     

一个RNAi载体上反向重复片段的测序策略

相邻的反向重复DNA片段有形成单链内二级结构的倾向,属于一种测序困难的DNA模板。解决RNAi载体插入的反向重复片段的测序问题,为该类载体正确性的测序验证奠定基础。采用常规分子克隆方法构建表达小麦TaATG2串联反向重复片段的RNAi载体,设计2种策略对经菌落PCR初步鉴定的载体进行测序验证:一种是以完整的载体质粒为模板进行测序;另一种是先对载体进行酶切处理,切除反向重复片段中的一个后对保留另一个片段的线性载体进行测序。结果表明,第一种测序策略受到串联反向重复片段形成的单链内部二级结构的影响,测序信号在反向重复片段处出现衰减或乱峰,无法读取序列。第二种测序策略排除了2个反向重复片段之间的干扰,保留在载体上的片段测序信号清晰,序列准确。采用酶切切除一个片段后进行测序的方法,经过2次酶切和2次测序可以有效地对载体上的2个反向重复片段分别进行序列测定,进而确认构建载体的正确性。     

M1胆碱受体选择性别构激动剂的虚拟筛选和体外活性研究

目的:M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M1受体)在改善学习和记忆等高级认知功能障碍中起重要作用,本文利用计算机辅助药物设计和高表达各M受体亚型的CHO细胞(Chinese hamster ovary cell,中国仓鼠卵巢细胞),以期筛选获得新型M1受体选择性别构激动剂。方法:通过计算机辅助药物设计方法,对已知具有M1受体选择性作用别构激动剂与M1受体的晶体结构进行对接,确定活性对接口袋,据此进行化合物库虚拟筛选;利用高表达各M受体亚型的CHO细胞,对化合物进行体外活性检测。结果:虚拟筛选得到184个化合物,其中,体外实验显示化合物AJ-292和AG-205-6对M1受体有明显的激动效果,而对M3、M5受体则无影响。结论:综合利用虚拟筛选、结构分析以及特异性活性分析,筛选出具有M1受体高选择性激动作用的化合物AJ-292和AG-205-6,为设计开发新型的M1选择性别构激动剂奠定了基础。