一种快速构建基因多个点突变体方法的建立

蛋白质内部多个位点的翻译后修饰在基因的功能调节过程中发挥重要作用,基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用,因此,高效、快速构建基因的多个点突变体在基因的功能研究中意义重大．本研究在建立了对目的基因进行高效准确的单点突变方法的基础上,以SRrp53点突变体的构建为例,设计了新型的以反向PCR为基础的多个点突变的实验流程,获得的多位点突变体质粒经测序后均与预期相符,将测序正确的多位点突变体质粒转染293T细胞后,均表达了分子质量正确的蛋白质．以上结果表明,该实验设计方案能够高效、方便地用于基因多个点突变体的构建,为进一步研究它们的分子功能打下了基础．     

替换基因片段对流感病毒生长的影响

摘要:【目的】探索流感病毒内部基因对病毒滴度的影响,构建高产流感疫苗种子病毒。【方法】将A/chicken/ZJ/China/2013(H5N1) (ZJ)病毒的6个内部基因或点突变体或聚合酶复合物基因逐个替换鸡胚高度适应的A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒(PR8)的相同基因,构建重组病毒,通过血凝试验比较重组病毒在鸡胚上的增殖滴度。【结果】PB2基因影响最大,替换后未能产生重组病毒;PB1、PA、M基因替换后,重组病毒滴度分别下降了3.7、3.4、3.0个滴度(log2);NS基因替换后基本没有影响;聚合酶复合体基因替换后,病毒滴度稍有下降(7.6 log2),没有提供像完全来自PR8的聚合酶复合体相同的生长特性(8.4 log2);PR8 PB2基因627位点替换成谷氨酸(E)后,病毒滴度从8.4 log2上升到8.7 log2。【结论】合适优化的基因组合可以通过病毒RNA与蛋白之间、蛋白与蛋白之间的相互作用促进病毒复制,从而筛选出能在鸡胚中高效复制的重组体,为高产流感疫苗的生产奠定基础。     

哈茨木霉β微管蛋白基因的克隆与序列分析

根据哈茨木霉T88菌丝体cDNA文库中的β微管蛋白基因EST序列,采用反向PCR方法以哈茨木霉T88的基因组DNA为模板,扩增得到了1.74kb的β微管蛋白基因编码区、1.5kb的5′非编码区和1.0kb的3′非编码区。哈茨木霉β微管蛋白基因编码446个氨基酸,与其它真菌β微管蛋白基因具有较高的序列同源性。对哈茨木霉β微管蛋白的三维结构进行了同源建模,模建的结果为研究哈茨木霉β微管蛋白自身特性及其与抗微管类杀菌剂的作用机制提供了分子基础。     

RNA病毒“拯救”技术

介绍了RNA病毒拯救技术体系建立的简要过程、拯救成功与否的主要影响因素以及优化拯救体系的主要研究进展。着重介绍了该技术在分子病毒学研究和疾病防制中的重要应用及发展前景。     

改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列

对传统的反向PCR技术作了一些改进：用巢式PCR扩增含量极少的靶序列;PCR反应体系中加入5%的甲酰胺以减少非特异性扩增.结果表明,改进的反向PCR体系是克隆人基因组已知片段旁侧序列的高度灵敏、高度特异的方法.     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒致病性的影响分析

目的利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/San-Jiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50～106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致;rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

δ-阿片受体在缺血后处理心肌保护中的作用

目的：探讨δ-阿片受体是否参与缺血后处理对抗心肌缺血/复灌（I/R）损伤和心肌细胞低氧/复氧（H/R）损伤作用及其机制。方法：采用离体大鼠心脏Langendorff灌流模型,全心停灌30 min、复灌120 min复制I/R模型。测定心室力学指标和复灌时冠脉流出液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性,实验结束测定心肌组织formazan含量。酶解分离的心肌细胞采用低氧60min、复氧60min复制H/R模型,测定心肌细胞存活率。结果：在离体心脏模型上,与I/R组相比,缺血后处理组（停灌后复灌即刻立即给予6次全心停灌/复灌循环）心肌组织的formazan含量明显增高,复灌期间冠脉流出液中LDH明显降低,同时缺血后处理明显改善心室力学指标,缓解冠脉流量的减少 在分离心肌细胞模型上,低氧后处理明显提高心肌细胞存活率。δ-阿片受体阻断剂naltrindole（NTI）和线粒体钙激活钾通道（KCa）阻断剂paxilline（Pax）在离体大鼠心脏模型和分离心肌细胞模型上均能明显减弱缺血后处理的作用。在心肌细胞模型上,与H/R组相比,δ-阿片受体激动剂DADLE明显提高心肌细胞存活率,其作用可被paxilline所阻断。结论：缺血后处理具有抗心肌缺血/复灌损伤的作用,这种保护作用可能与其激活δ-阿片受体和开放KCa有关。     

大豆细胞核雄性不育基因研究进展

雄性不育是指植物雄蕊不能正常生长和产生有活力花粉粒的现象。利用雄性不育突变体开展杂交育种工作,是快速提高作物单产的有效途径。目前,通过杂种制种已大幅度提高了水稻(Oryza sativa L.)、玉米(Zea mays L.)和小麦(Triticum aestivum L.)等作物的产量。大豆(Glycinemax(L.)Merr.)作为自花授粉作物,通过人工去雄生产杂交种子不仅困难而且经济上不可行。由于适用于杂交种生产的不育系资源短缺,目前大豆还没有实现大规模杂种优势利用。因此,快速实现大豆杂种优势利用迫切需要鉴定稳定的大豆雄性不育系统。本文总结了大豆细胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)突变体及不育基因研究进展,同时结合拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻和玉米中已报道的细胞核雄性不育基因,从反向遗传学的角度,为大豆核雄性不育基因的鉴定提供依据。     

反向遗传学技术在疫苗研究的进展

本文通过反向遗传学技术的基本原理,发展历史和反向遗传学技术在疫苗研究方面的进展与应用,重点介绍了反向遗传学技术在流感病毒疫苗方面的应用。     

发展中的酵母杂交体系

酵母杂交体系包括双杂交、反向双杂交和三杂交等体系。双杂交作为一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用的方法,已经得到了广泛的应用。而反向双杂交和三杂交系统是在双杂交基础上发展起来的两种新技术。反向双杂交除了筛选突变株,以获取蛋白质结合的信息外,还能发现可导致已知蛋白质间特异相互作用发生解离的肽类或其他小分子物质,进一步分析蛋白质间作用位点、调控。三杂交系统则在蛋白质与小分子配基之间以及多种蛋白质之间相