TAI系列I中的冰草染色体与小麦部分同源关系的同工酶研究

本文分析了ＴＡＩ系列Ｉ及其亲本的胚乳氧化物酶,苹果酸脱氢酶,醇脱氢酶,酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的酶谱表型。把冰草同工酶结构基因Ｍｄｈ－Ａｇ＾ｉ２定位一ＴＡＩ－１３,基因Ｃｐｘｅ－Ａｇ＾ｉ２定位到ＴＡＩ－１４,基因Ａｄｈ－ＡＧ＾Ｉ１,Ａｃｐｈ－Ａｇ＾ｉ２和Ｐｈｅ－Ａｇ＾ｉ２定位到ＴＡＩ－１６中的冰草染色体上。根据这些基因定位和我们以前的研究工作,结合植株表型分析,推测ＴＡＩ－１１,ＴＡＩ－１２,ＴＡＩ     

靶向Bcl-2克服非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药

摘要 目的：探讨靶向抗凋亡蛋白Bcl-2克服非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药的作用及重定位Bcl-2靶向抑制剂用于克服耐药的可行性。方法：通过药物浓度梯度递增法构建非小细胞肺癌多代EGFR-TKIs耐药株,根据亲本细胞和多代EGFR-TKIs耐药的非小细胞肺癌细胞的RNA-seq数据筛选出潜在耐药相关基因Bcl-2,通过Western blot 检测其在耐药细胞中的蛋白水平。为了探讨Bcl-2诱导耐药的作用,采用siRNA干扰和使用Bcl-2的抑制剂ABT199抑制Bcl-2,通过CCK8法、IncuCyte实时监测和Western blot等方法检测其对亲本和耐药细胞的细胞活力、药物敏感性、增殖和凋亡的影响。随后使用奥希替尼分别处理亲本及耐药细胞,通过Western Blot检测NRF2受到药物作用后及在耐药细胞中的蛋白水平,并以临床公共数据库分析辅助验证。使用siRNA干扰或NRF2抑制剂ML385敲低或抑制NRF2功能,借助Western Blot和CCK8法检测其对Bcl-2表达水平及对EGFR-TKI敏感性的影响;通过加入NRF2的激动剂Ki696探究其对Bcl-2的诱导作用、对EGFR-TKI敏感性的影响及取消靶向Bcl-2逆转耐药的作用。结果：Bcl-2在EGFR-TKIs耐药细胞中上调;敲低或抑制Bcl-2后,可选择性抑制耐药细胞的生长和活力,并诱导凋亡,且能逆转包括第三代药物奥希替尼在内的多代EGFR-TKIs耐药;EGFR-TKI可在敏感细胞中诱导NRF2的上调,且耐药细胞中上调的Bcl-2受NRF2调控。结论：EGFR-TKIs耐药细胞通过上调抗凋亡分子Bcl-2获得耐药,该分子的上调受NRF2的调控,靶向Bcl-2则可以逆转耐药。     

艰难拟梭菌毒素致病机制及毒素基因调控的研究进展

艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)是一种产芽孢的革兰氏阳性专性厌氧杆菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。艰难拟梭菌产生的毒素A和毒素B在其致病过程中发挥关键作用。毒素发挥毒性作用依赖其4个功能结构域:葡萄糖基转移酶结合域、半胱氨酸蛋白酶结合域、易位域和受体结合域。毒素的受体结合域识别并结合细胞表面受体,介导毒素内吞并形成内体。经过自体催化切割,毒素将真正的毒性片段——葡萄糖基转移酶结合域释放到胞浆中,葡萄糖基转移酶能够失活宿主肠上皮细胞内的GTP酶导致细胞骨架解聚和坏死,进而引起腹泻和伪膜性结肠炎等临床症状。艰难拟梭菌毒素产生受致病基因座内及基因座外许多调控因子的调节。tcdR和tcdC基因位于致病基因座内,对毒素基因的表达分别起促进和抑制作用,而基因座外如spo0A、codY等基因则通过抑制tcdR的表达从而间接影响毒素蛋白产生。本文将重点介绍艰难拟梭菌毒素的致病过程和影响毒素基因表达的分子调控机制,以期为开发针对毒素的治疗手段提供新思路。     

天兰冰草染色体对小冰麦外植体再生能力的影响及基因的染色体定位

本文研究了天兰冰草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ２ｎ＝４２）染色体导入小麦后对小冰麦外植体再生能力的影响,从而分析调控再生能力的基因所在天兰冰草染色体的定位。对异源八倍体小冰麦的研究表明,与天兰冰草强再生能力有关的基因主要分布在附加到中２的冰草染色体组上;对７个异附加系小冰麦的研究进一步表明,冰草强再生能力的性状由多基因调控,这些基因主要分布在附加到ＴＡＩ－１１、ＴＡＩ－１２、ＴＡＩ－１３的冰草染色体上。此外,小冰麦杂种Ｆ１的研究表明,在组织培养中同样能够表现出杂种优势。     

小麦Kr基因在小麦与玉米或鸭茅状摩擦禾杂交中的失活

用３７个小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）品种（系）为母本,分别与黑麦（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）、球茎大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｂｕｌｂｏｓｕｍ）、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）和鸭茅状摩擦禾（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）杂交,比较其亲和性,小麦和玉米或鸭茅状摩擦禾杂交比小麦与黑麦或球茎大麦杂交的亲和性显著提高。携带着显性Ｋｒ１和Ｋｒ２基因的小麦品种Ｈｏｐｅ与黑麦杂交,不能形成胚,而与玉米及鸭茅状摩擦禾杂交时,成胚率分别达１６．００％和３２．５０％。表明控制小麦与黑麦及球茎大麦杂交亲和性的Ｋｒ基因系统在小麦与玉米及小麦与鸭茅状摩擦禾属间杂交中失活。讨论了还存在有其它控制小麦属间杂交亲和性的遗传调控系统的可能性。     

含吸氢酶基因（hup）嵌合质粒的构建和吸氢酶活性在阴沟肠杆菌中的表达

以质粒ｐＲＫ４０４为载体亚克隆含大豆根瘤菌吸氢酶结构基因（ｈｕｐ）的片段,构建成嵌合质粒ｐＨＲ１１、ｐＨＲ４和ｐＨＲ１０。通过三亲本杂交将这些嵌合质粒导入无吸氢活性的Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ２４１菌株（Ｈｕｐ－）,均获得Ｈｕｐ＋的接合子。利用启动子检测质粒ｐＭＰ２２０证明,在ｈｕｐ对结构基因上游１．２ｋｂ内存在ｈｕｐ启动基因片段。以ｐＲＫ２０１３为助质粒可将ｐＨＲ１１导入Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ和Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ等土壤固氮菌株。本文以接合子Ｅ．ｃｌｏａｃａｅＥＨ１１１３为例,通过对基因组ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析证明,嵌合质粒ｐＨＲ１１在ＥＨ１１１３中稳定贮存和复制。Ｈ２诱导接合子ＥＨ１１１３吸氢酶活性高表达,吸氢活性与放氢活性比值约为对照的两倍。当以延胡索酸为电子受体时,吸氢酶的吸氢作用支持菌株固氮酶活性的提高。     

水稻蜡质基因5＇上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻蜡质基因（ｗａｘｙ）５＇上游调控区中存在的顺式作用元件,我们将水稻ｗａｘｙ基因翻译起始声、（ＡＴＧ）５＇上游３．４ｋｂ（－２１１８～＋１２９１ｂＰ）片段经外切核酸酶ＥｘｏⅢ部分酶解,得到一系列５＇端缺失的片段。将这些缺失片段分别与ｇｕｓ基因编码区连接,构建成融合质粒,经ＰＥＧ介导引入水稻原生质体,２６℃培养４８ｈ后,定量测定ＧＵＳ酶活力,并以同时导入的由３５Ｓ启动子指导的荧光素酶（ＬＵＣ）基因表达的酶活力作为内对照。结果表明,ＧＵＳ酶活性随５’上游调控区长度的减少而逐渐减弱。由─８６１ｂｐ缺失至─６４０ｂＰ时,ｇｕｓ基因表达水平有较明显的降低,推测在该区域中可能存在一个顺式作用元件区。     

大肠杆菌rpoH基因的克隆,表达及其产物的纯化

本文用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ３２的编码基因ｒｐｏＨ,并克隆在含有ｔａｃ启动子的表达载体ｐＵＨＥ中,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中表达了Ｃ端融合有６个寡聚组氨酸的σ３２。表达产物经金属螯合层析一步纯化,达到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银染一条带纯度,氨基酸组成分析及Ｎ端序列分析结果与文献报道一致。３５Ｓ细胞内参入实验表明：即使在较低的温度下,表达产物σ３２（Ｈｉｓ）６也能导致热休克蛋白如ＧｒｏＥｌ、ＤｎａＫ、Ｈｔｐ的大量合成．     

蝮蛇毒碱性磷脂酶A_2基因的克隆

从蝮蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ．利用人工合成寡核苷酸引物作逆转录,以ｃＤＮＡ为模板进行体外扩增,获得磷脂酶Ａ２（简称ＰＬＡ２）基因,克隆至ｐＢＳ－ｋｓ载体中。通过对３个碱性ＰＬＡ２（简称ＢＰＬＡ２）基因单独克隆分别作ＤＮＡ全序列分析,推导ｐｒｏ－ＢＰＬＡ２由１３８个氨基酸残基构成,与已测定的部分氨基酸序列比较,基本相符。该基因成功的克隆,不仅推导出ＢＰＬＡ２的蛋白质全序列,也为进一步开展蛇毒功能肽蛋白质工程的研究工作打下了良好的基础。     

人体β-珠蛋白基因5’旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的相互作用

人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肝和K 562细胞中则处于关闭状态。凝胶电泳阻抑法分析发现,在人胎儿肝,成年肝及K 562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件(-372到-194 bp)相结合的红系组织特异性的调控因子。竟争试验的结果表明,成年肝和K 562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5'旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相似性,这两种细胞的调控因子既结合于负调控区(NCR 2)也结合于正调控区,说明两种细胞中β-珠蛋白基因的关闭机制可能是相似的。胎儿肝的核蛋白因子只结合于负调控区,推测在胎儿期存在独特的关闭机制。