NADPH缺陷型Corynebacterium glutamicum重组菌株的构建及其性能分析

[目的]改造谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中NADPH合成途径,阻断胞内NADPH的合成,获得1株NADPH营养缺陷型菌株。[方法]通过失活L-赖氨酸高产菌C. glutamicum Lys-χ中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)和苹果酸酶(MalE)并将NADP~+依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP~+-Icdcg)替换成变形链球菌(Streptococcus mutans)中的NAD~+-Icdsm,阻断胞内NADPH的合成。随后结合辅因子工程,引入大肠杆菌(Escherichia coli)中膜结合吡啶核苷酸转氢酶(PntAB)并通过不同强度启动子控制PntAB的表达水平。最后,分析不同重组菌中胞内氧化还原水平和L-赖氨酸生产强度的变化。[结果]重组菌C.glutamicum Lys-χΔZMI_(Cg)::I_(Sm)(即Lys-x1)胞内检测不到NADPH,为1株NADPH营养缺陷型菌株。该重组菌只在以葡萄糖酸为碳源的基础培养基中生长和积累L-赖氨酸,而以葡萄糖、丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸为碳源时无法生长。此外,表达E.coli中的PntAB可回补重组菌Lys-χ1胞内NADPH的水平,但由于不同强度启动子控制PntAB表达水平不同,重组菌胞内NADPH水平也不同,并影响L-赖氨酸的生产强度。[结论]重组菌Lys-χ1可作为有效的底盘细胞,用于考察不同的NADPH再生策略,获得不同胞内NADPH水平的重组菌株,为进一步阐明NADPH调控微生物细胞生理代谢功能的机制提供研究基础。     

钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

双歧杆菌预防早产儿坏死性小肠结肠炎的疗效观察

目的 探讨双歧杆菌预防早产儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的疗效.方法 随机分成试验组和对照组,对照组给予常规治疗,试验组在对照组基础上给予双歧杆菌治疗.观察两组不同胎龄和不同出生体重早产儿NEC患病率、治疗前后肠道各菌群变化的差异.结果 (1)试验组NEC总发生率显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);(2)试验组出生体重＜1500g早产儿NEC发生率显著低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);(3)治疗后试验组细菌总数、球菌总数及杆菌总数上升幅度显著大于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.01);治疗后试验组杆球菌比值较对照组显著下降,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 双歧杆菌可有效预防早产儿坏死性小肠结肠炎.     

金双歧联合丁螺环酮治疗肠易激综合征的临床疗效观察

目的 观察并分析金双歧联合丁螺环酮治疗肠易激综合征的临床疗效.方法 对80例门诊患者,年龄在18～70岁,采用随机数字表法,分为治疗组40例,采用金双歧联合丁螺环酮治疗;对照组40例,采用单用金双歧治疗,两组其他内科常规治疗相同,疗程4周,评估两组治疗前后临床疗效及汉密尔登焦虑(HAMA)和汉密尔登抑郁(HAMD)量表评分变化.结果 治疗前,两组IBS症状、肠外症状、生活质量、汉密尔登焦虑和抑郁量表评分比较差异无统计学意义.治疗后两组IBS症状、肠外症状、生活质量治疗后均较治疗前明显改善,联合治疗组较单用金双歧组更显著.汉密尔登焦虑和抑郁量表评分两药联合治疗后显著改善,但单用金双歧无明显改善.结论 金双歧联合丁螺环酮治疗肠易激综合征,安全、有效、不良反应少.     

革兰阴性杆菌10年耐药性变化分析

目的 对重庆医科大学附属第二医院2001年1月1日至2009年12月31日10年临床标本中分离的主要革兰阴性杆菌耐药性变化进行分析,为临床合理用药提供依据.方法 采用回顾性方法对十年间大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和不动杆菌的药敏结果用WHONET 5.4软件进行统计分析.结果 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药率小于5％;对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟耐药率小于30％;对三代头孢、头孢西丁和氨曲南耐药率为40％左右;对青霉素类、喹诺酮类和磺胺类耐药率大于50％.铜绿假单胞菌对头孢他啶、头孢吡肟和亚胺培南耐药率小于40％;对其余监测抗生素耐药率大于50％.不动杆菌属对亚胺培南耐药率小于25％(2009年除外),对其余监测抗生素耐药率很高,维持在50％ ～ 96％.铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌泛耐药菌检出率分别为0～14％和0～48％.结论 革兰阴性杆菌对常用抗菌药物的耐药已非常普遍,且有逐年升高的趋势;肠杆菌科对碳青霉烯类、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟耐药率相对较低;非发酵菌耐药性增加明显,铜绿假单胞菌、不动杆菌泛耐菌增加明显;严格控制抗菌药物的应用及耐药菌和泛耐药菌的传播和爆发流行已迫在眉睫.     

凝结芽孢杆菌活菌片预防先兆流产保胎妇女胃肠功能紊乱的临床观察

目的观察凝结芽孢杆菌活菌片（商品名：爽舒宝）预防先兆流产保胎妇女胃肠功能紊乱的临床疗效。方法将60例先兆流产保胎妇女随机分为爽舒宝预防组和对照组,预防组30例,对照组30例,两组均给予常规服用保胎药物,出现顽固性便秘后用开塞露通便,其中预防组在此基础上同时口服凝结芽孢杆菌活菌片首次2. 1 g,以后1.05 g/次,3次/d,温水送服,疗程2-4周。观察保胎期间孕妇胃肠功能紊乱情况和使用开塞露的通便次数。结果预防组患者胃肠功能紊乱的发生率显著低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05 ）。结论凝结芽孢杆菌活菌片预防先兆流产保胎妇女胃肠功能紊乱疗效显著,值得临床推广。     

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA基因检测及同源性分析

目的 了解台州地区碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的耐药性、碳青霉烯酶基因型以及同源性.方法 63株碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌经VITEK2 Compact进行细菌鉴定及药敏分析,用K-B法复核药敏结果,采用多重PCR扩增分析碳青霉烯酶的基因型;采用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分析其同源性.结果 63株菌株为多重耐药菌株,除多粘菌素、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦外,对其他常用抗生素的耐药率均在70％以上.63株菌株检测出OXA-51基因60株(95.2％),OXA-23基因58株(92.1％),两个基因同时存在的有58株(92.1％).PFGE结果显示碳青霉烯类鲍曼不动杆菌主要分为5个克隆型,其中A、B两个为主型.结论 产OXA酶是台州地区耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的主要耐药机制之一,其中OXA-23是主要的基因型.     

双歧杆菌四联活菌片对肝硬化白发性细菌性腹膜炎患者肠黏膜屏障和炎症因子的影响

目的探讨双歧杆菌四联活菌片对肝硬化自发性细菌性腹膜炎（SBP）患者肠黏膜屏障和炎症因子的影响。方法选择乙肝后肝硬化SBP患者68例,分为治疗组和对照组。两组患者均予以低盐饮食、护肝利尿、补充白蛋白和抗感染等基础治疗。治疗组在此基础上予以双歧杆菌四联活菌片口服,1．5g／次,3次／d,连用6周。结果治疗6周后,两组血浆内毒素、PCT和尿L／M比值比较均有明显下降（对照组比较P〈0．05,或治疗组比较P〈0．01）,且治疗组下降幅度明显优于对照组（P〈0．05）;两组血浆TNF-α、IL-6和IL-10水平均有明显下降（对照组比较P〈0．05,或治疗组比较P〈0．01）,且治疗组下降幅度明显优于对照组（P〈0．05）。治疗组临床总有效率明显高于对照组（χ2=8．17,P〈0．01）,治疗期间未发生严重的药物不良反应。结论双歧杆菌四联活菌片治疗肝硬化SBP患者具有较好的临床疗效及安全性,对患者肠黏膜屏障功能具有良好保护和改善作用,并能下降血浆TNF—α、IL-6和IL-10水平,具有辅助治疗肝硬化作用。     

鲍曼不动杆菌耐消毒剂基因检测

目的 了解深圳市人医院鲍曼不动杆菌抗季铵盐类消毒剂基因的检出率及基因型特点.方法 收集深圳市人民医院临床标本中分离鲍曼不动杆菌67株,PCR检测分离株的qacA/B、qacE△1、qacC、qacG和qacJ 5种抗季铵盐类消毒剂基因.结果 67株鲍曼不动杆菌中qacE△l基因阳性42株(62.6％),qacA/B与qacG基因各有一菌株阳性,未检测出qacC或qacJ基因阳性菌株.结论 深圳市人医院鲍曼不动杆菌中抗季铵盐类消毒剂基因检出率较高,主要为qacE△1型.     

薰衣草精油和芦荟对痤疮面部主要菌群的影响

目的 体外观察薰衣草精油和芦荟水提物对痤疮患者面部痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的作用,为改善面部痤疮治疗提供理论依据.方法 采用连续梯度稀释法稀释薰衣草精油及芦荟水提物,纸片法观察不同浓度的精油和芦荟水提物对面部正常菌群表皮葡萄球菌和痤疮主要致病菌痤疮丙酸杆菌的作用;通过抑菌环的大小反应抑菌作用强弱,测定生长曲线以观察对细菌生长繁殖的影响.结果 薰衣草精油对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用明显强于表皮葡萄球菌(P＜0.05);两种芦荟(库拉索芦荟和木立芦荟)对痤疮丙酸杆菌均无抑菌作用(P＞0.05);库拉索芦荟对表皮葡萄球菌有微弱的抑制作用(P＜0.05);木立芦荟对表皮葡萄球菌生长有促进作用.结论 薰衣草精油和芦荟水提物对痤疮患者面部主要细菌表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的作用效果不同,薰衣草精油和木立芦荟水提物联合应用有可能通过调整面部微生态平衡从而改善痤疮症状.