人-鼠嵌合Fab片段的温度诱导表达

构建了具有λＰＲＰＬ启动子高效表达人鼠嵌合Ｆａｂ片段的温度诱导表达型载体ｐＨＺ０１,并在大肠杆功中表达了三种嵌合Ｆａｂ片段：抗前列腺特异抗原（ＰＳＡ）的嵌合Ｆａｂ,抗溶菌酶（ＨＥＬ）的嵌合Ｆａｂ和抗破伤风类毒素（ＴＴ）的嵌合Ｆａｂ,三种表达的可溶性嵌合Ｆａｂ都具有特异结合抗原的能力,嵌合Ｆａｂ的ＣＨ１和ＣＫ区均为人源的,较之鼠源Ｆａｂ具有更好的应用前景。     

酶的基因剂量效应及其对鱼类远缘杂交的影响

亲缘关系较远的杂种二倍体,酶的表达出现父本基因受抑制,双亲基因表达迟缓和母本基因提前表达三种类型的紊乱。由于双亲等位基因不亲和,各等位基因只调控产生1／2的基因产物,从而致使胚胎出现“双单倍体综合症”而在孵化期全部死亡。远缘杂交三倍体由于母本基因剂量加倍,一方面抑制了父本基因的表达,消除了不协调基因活动的干扰,另一方面母本基因产物趋于正常,代谢得以正常进行,杂种后代能成活并正常生长。     

黄瓜CsERECTA基因的原核表达及其多克隆抗体制备

ERECTA基因编码一个富含亮氨酸重复序列结构的丝/苏氨酸类受体蛋白激酶,参与调控植物器官的形态建成,在株型控制及抗逆方面也有重要作用。该研究通过构建带有maltose binding protein(MBP)标签的pET21a-CsERECTA融合蛋白原核表达载体,实现了在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达,并对诱导表达的温度、时间和IPTG浓度进行了优化。利用镍离子螯合层析纯化得到MBP-CsERECTA融合蛋白,再用rTEV蛋白酶对其进行酶切,得到CsERECTA蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体。结果表明,黄瓜CsERECTA蛋白以可溶和包涵体2种形式表达,低温有助于蛋白以可溶性形式大量存在。最佳诱导温度为23℃,诱导时间为6h,IPTG浓度为0.5mmol·L~(-1)。通过Western blot可检测到黄瓜内源的CsERECTA蛋白,说明制备的多可隆抗体具有较好的特异性。多克隆抗体的成功制备为进一步研究CsERECTA的功能奠定了基础。     

狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。     

鼠源戊型肝炎病毒IgG抗体定量检测方法的建立

目的制备鼠源戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)抗体定量参考品,建立小鼠HEV IgG抗体定量检测方法,并对其进行验证及初步应用。方法制备鼠源抗-HEV IgG参考血清MS1,以世界卫生组织人源抗-HEV Ig标准品(NIBSC code:95/584)对其进行标定并检测其稳定性;以标定的参考品为标准,建立小鼠HEV IgG抗体定量检测方法,对线性、范围、重复性、准确度等进行验证,并对戊肝疫苗免疫后小鼠血清进行HEV IgG抗体定量检测。结果制备的MS1血清含量为30.9U/m L(95%CI:±1.1),CV为4.8%;加速稳定性试验和冻融稳定性试验中,MS1含量CV均15%。建立的小鼠抗-HEV IgG抗体定量检测方法在0.01~0.15 U/m L范围内具有良好的线性(r0.99);灵敏度为0.007 U/m L;对高、中、低3份不同含量抗-HEV阳性小鼠血清重复检测3次,CV均10%;加样回收率为83.8%~107.7%。戊肝疫苗免疫1 w,3 w,5 w时,小鼠血清HEV IgG抗体均值分别为0.3 U/m L、39.4 U/m L、345.4 U/m L。戊肝疫苗初次免疫小鼠1 w后抗体阳转率为100%,但抗体均处于较低水平;血清抗体水平随着免疫针次的增加而升高(P0.05)。结论制备的鼠源HEV IgG抗体定量参考稳定性良好的,建立的小鼠HEV IgG抗体定量检测方法,具有良好的灵敏度、重复性及准确度,可用于小鼠实验中戊肝疫苗免疫原性的评价。     

阳离子脂质体DOTAP佐剂对H5N1流感病毒裂解疫苗免疫效果的影响

目的研究阳离子脂质体DOTAP佐剂对H5N1型流感病毒裂解疫苗免疫效果的影响。方法制备DOTAP阳离子脂质体流感病毒裂解疫苗(简称DOTAP流感裂解疫苗),检测其包封率。将BALB/c小鼠分为13组,分别用含0.1、1.0、10.0μg HA/只剂量以DOTAP、Al(OH)3、CPG-ODN为佐剂以及不含佐剂的流感裂解疫苗于0、21天皮下免疫,PBS作为对照组,用血凝抑制试验检测小鼠初次免疫后21、42天血清HI抗体滴度;用ELISA检测初次免疫后21、42天血清特异性IgG抗体、IgG1、IgG2a亚类抗体滴度,以及初次免疫后42天小鼠脾脏单个核细胞体外经抗原刺激后细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌水平。将BALB/c小鼠分为3组,分别用含不同DOTAP剂量(100、300、600μg/只)的DOTAP流感裂解疫苗于0、21天皮下免疫,检测初次免疫后21、42天小鼠血清HI抗体滴度和IgG抗体滴度。结果 DOTAP流感裂解疫苗粒径在300~400 nm,带正电荷,包封率在50%以上;DOTAP流感裂解疫苗诱导的HI抗体水平和特异性IgG抗体水平均高于流感裂解疫苗,而与铝佐剂和Cp G-ODN佐剂间差异无统计学意义;DOTAP流感裂解疫苗产生的抗体仍以IgG1亚类抗体为主,免疫后42天诱导的IgG2a亚类抗体水平高于流感裂解疫苗和铝佐剂,低于Cp G-ODN佐剂;DOTAP流感裂解疫苗免疫后既分泌高水平Th1型细胞因子IFN-γ,同时也分泌高水平Th2型细胞因子IL-4;不同DOTAP剂量的DOTAP流感裂解疫苗免疫后,其HI抗体滴度和IgG抗体滴度在低、中、高剂量组之间存在明显的量效关系。结论 DOTAP作为H5N1型流感病毒裂解疫苗的佐剂可显著提高流感裂解疫苗的免疫原性,其对体液免疫应答的增强作用不低于铝佐剂和Cp G-ODN佐剂,并具有诱导细胞免疫应答的能力。     

18～60岁健康人群肺炎链球菌IgG抗体水平调查

目的了解18~60岁健康人群肺炎链球菌IgG抗体水平,为肺炎链球菌性疾病的预防与控制提供参考依据。方法选取甘肃、宁夏健康献浆员为调查对象,分为18~30、31~40、41~50、51~60岁4个年龄组,共调查347人。采用WHO推荐的标准化酶联免疫吸附试验检测12种肺炎链球菌血清型IgG抗体水平,并计算IgG抗体阳性率和几何平均浓度(Geometric mean concentration,GMC)。结果质控血清QC907的IgG抗体浓度均值与参考值之间的误差百分数均未超过±40%,测定值符合其参考值范围,各血清型抗体浓度检测结果的CV均30%。347份血清样品肺炎链球菌IgG抗体总阳性率为64.8%~96.0%,GMC为0.37~2.24μg/m L。不同血清型间IgG抗体GMC差异具有统计学意义(P0.05)。不同年龄组同种血清型IgG抗体阳性率及GMC均无统计学意义(P0.05)。除19F型外,不同地区同种血清型IgG抗体阳性率均有统计学意义(P0.05);除4、7F、14和18C型外,不同地区同种血清型IgG抗体GMC间差异均有统计学意义(P0.05)。结论 18~60岁健康人群肺炎链球菌IgG抗体水平普遍较高,对肺炎链球菌主要流行血清型均具有一定的保护力。     

绿盲蝽气味受体基因AlucOR40的克隆及功能研究

【目的】从绿盲蝽Apolygus lucorum触角中克隆气味受体基因Aluc OR40,研究该气味受体基因在绿盲蝽不同组织中的表达水平,然后对该基因的功能进行研究,为理解绿盲蝽的嗅觉识别机制提供理论基础。【方法】在绿盲蝽成虫触角转录组测序与分析的基础上,通过PCR技术克隆得到气味受体基因Aluc OR40的全长序列。用半定量RT-PCR研究该基因在雌雄虫不同组织中的表达水平。然后通过爪蟾卵母细胞体外表达该基因,并结合双电极电压钳检测了该气味受体对60种气味分子包括绿盲蝽性信息素组分和植物挥发物的反应。然后,利用触角电位技术测定羽化后3 d的绿盲蝽成虫对Aluc OR40的气味配体的触角电位反应。【结果】克隆了Aluc OR40(Gen Bank登录号:KU886190)。Aluc OR40编码398个氨基酸,蛋白具有7个跨膜结构域,N末端位于胞内,C端位于细胞外,符合昆虫气味受体的典型特征。半定量RT-PCR的结果显示,Aluc OR40在触角中特异表达,且在雄虫触角中的表达水平高于雌虫。双电极电压钳记录结果显示,Aluc OR40只对反-2-己烯醇一种气味分子具有特异反应。EAG实验结果表明,羽化后3 d的绿盲蝽雌雄虫都对反-2-己烯醇有反应,且雄虫触角的EAG反应显著高于雌虫。【结论】结果提示Aluc OR40参与了绿盲蝽对反-2-己烯醇的识别过程,推测其在绿盲蝽交配过程中雄虫对雌虫的识别中发挥作用。     

雌性偏好促进象型类的性别异时进化（英文）

性双型的特征通常被认为产生于种内争夺交配优先权的斗争。例如,现生和化石的雄性长鼻类动物具有较大的体型和较粗壮的上门齿。本研究阐释了如下现象:化石象型类动物(Elephantiformes,长鼻类的主要类群)一些性双型特征与其进化历史具有相关性,而与性别竞争并非直接相关。在中新世的葛氏铲齿象(Platybelodon grangeri)和狭齿嵌齿象(Gomphotherium angustidens)中,雄性比雌性倾向于具有进化中更进步的特征,如同雄性在进化中领先雌性一步。这种现象可能与雌性偏好的机制相耦合。在象型类动物进化的早期(繁荣期),性别选择压促使雄性比雌性产生更加显著的进步特征;然而,在它们进化的晚期(衰退期),性别选择压似乎减弱,性别的异时进化也减少。这种新的发现或许在大型有蹄类的演化过程中有一定的普遍意义,因为那些繁荣的类群中通常性双型显著,如鹿科和牛科;而衰落的类群中通常性双型不显著。     

毛竹花粉的形态及双受精过程研究

由于实验的材料、条件和技术的限制,关于竹类花粉形态、花粉管生长过程的研究十分少见。毛竹( Phyllostachys edulis)属于禾本科( Poaceae/Gramineae)竹亚科( Bambusoideae)植物,在我国广泛分布,具有重要的经济、生态和文化价值。由于其独特的生殖生物学特性,即开花周期长、结籽率低,所以对其开花材料的获取十分困难。该研究在其独特的开花特性基础上,结合野外实地观察,利用显微镜、环境扫描电镜、荧光显微镜等,对毛竹的花粉形态、结构以及花粉管的萌发与生长动态进行了首次报道。结果表明：(1)毛竹花粉近球形,平均直径为61.00μm,属于大型孢子。(2)毛竹成熟花粉落到雌蕊柱头上后,经过花粉与柱头的成功识别,开始萌发,并形成花粉管;随着花粉管的逐渐伸长生长,依次经过柱头和花柱,到达子房;约120 min后到达珠孔处,进入胚珠和胚囊,完成双受精作用。通过对毛竹花粉形态结构和花粉管生长至受精过程的动态观察,为毛竹花粉可授性、花粉生理、生化研究提供了实验技术准备。该研究结果完善和丰富了毛竹乃至整个禾本科植物在生殖生物学方面的研究内容。