利用扁桃斑鸠菊叶发酵高产粗毛纤孔菌胞外多糖的条件优化及其抗氧化活性研究

粗毛纤孔菌胞外多糖是粗毛纤孔菌液体发酵的重要活性代谢产物,但采用常规的发酵方法,粗毛纤孔菌胞外多糖的产量较低。为更好地获取粗毛纤孔菌胞外多糖,本文采用双向液体发酵的方法,通过向发酵培养基中添加适量的扁桃斑鸠菊叶粉末,来提高粗毛纤孔菌胞外多糖的产量,并对优化得到的胞外多糖抗氧化活性进行了研究。以发酵液中胞外多糖含量为指标,采用单因素实验和正交实验优化发酵条件;采用红外光谱对胞外多糖的结构特征进行分析;通过测定胞外多糖对ABTS、DPPH和羟基自由基的清除率来了解其抗氧化活性。结果表明,最优发酵条件为:扁桃斑鸠菊叶粉末添加量0.5g/L、发酵时间10d、pH 6.5、接种量5.0mL,在此条件下,粗毛纤孔菌胞外多糖的产量达到(2.34±0.25)mg/mL,与未添加扁桃斑鸠菊叶的空白组相比,其胞外多糖产量提高了约216.22%;红外分析与抗氧化活性实验结果表明,添加扁桃斑鸠菊叶后的胞外多糖与未添加扁桃斑鸠菊叶的胞外多糖红外主要吸收峰一致,并且对ABTS、DPPH以及羟基自由基清除能力相近。本研究结果表明扁桃斑鸠菊叶能够有效地提高粗毛纤孔菌胞外多糖的产量,为其他珍稀食药用菌胞外多糖的高效生产提供了新思路。     

三种车前草的黄酮提取、纯化及其抗氧化活性分析

本研究采用响应面设计优化超声辅助提取车前总黄酮的最佳条件,然后用此条件提取大车前和平车前总黄酮,并探究大孔树脂纯化对三种车前草总黄酮抗氧化活性的影响。结果表明,在超声温度60℃、乙醇浓度70%的条件下,车前总黄酮最佳提取工艺参数为液料比20:1 m L/g、超声时间80 min、超声功率210 W,车前、大车前和平车前的总黄酮得率分别为5.04%、2.86%和1.22%。无论是纯化前还是纯化后,大车前总黄酮的还原力和对羟基自由基的清除作用最强,平车前最弱;车前总黄酮对DPPH自由基的清除作用最大,平车前最弱。纯化前后的还原力和对DPPH自由基、羟基自由基的清除作用都接近Vc的水平。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为NusA-hRI的应用提供理论依据。     

宁夏枸杞根和茎的化学成分及抗炎活性研究

研究宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)根部和茎部的化学成分。采用硅胶柱、ODS开放柱、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱及半制备反相高效液相等色谱手段,对宁夏枸杞根和茎部乙醇提取物的石油醚部位及乙酸乙酯部位化学成分进行分离纯化,根据其理化性质以及波谱数据鉴定得到12个化合物,分别为N-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxyethyl]-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide(1)、3-(4-hydroxy-3-methoxy phenyl)-N-2-(4-hydroxyphenyl)-2-methoxyethyl]acrylamide(2)、N-trans-coumaroyloctopamine(3)、(E)-2-(4,5-dihydroxy-2-{3-[(4-hydroxyphenethyl)amino]-3-oxopropyl}phenyl)-3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-N-(4-acetamidobutyl)acrylamide(4)、1,2-dihydro-6,8-dimethoxy-7-hydroxy-1-(3,4-dihydroxy-phenyl)-N1,N2-bis[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-2,3-naphthalene dicarboxamide(5)、(+)-syringaresinol(6)、zhebeiresinol(7)、(±)-eriodictyol(8)、isovanilin(9)、5,5′-dimethoxybiphenyl-2,2′-diol(10)、p-hydroxyphenethyltrans-ferulate(11)、E-ferulic acid hexacosyl ester(12),所有化合物均为首次从该植物中分离得到。此外,采用MTT法和抑制一氧化氮(NO)生成实验,从细胞毒活性和抗炎活性两方面评估了化合物的生物活性。结果表明,化合物2具有显著的抗炎活性,其IC50值(17.00±1.11μmol/L)小于阳性对照药槲皮素的IC50值(17.21±0.50μmol/L)。     

结核分枝杆菌多表位诊断抗原的制备

将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)多个B细胞预测表位串联表达(命名为B102),并初步评价其作为诊断抗原的血清学诊断价值。将MtbPstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6个蛋白的11个B细胞预测表位串联,加入合适的连接臂后全基因合成;将多表位片段插入带有TRX标签的表达质粒中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并利用Ni~(2+)-Chelating亲和层析和DEAE阴离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western blotting (WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立Mtb抗体检测竞争法ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。目的蛋白以包涵体形式存在,其表达量约占菌体总蛋白的31.25%,经纯化及复性后蛋白B102可溶性存在,浓度为3.124mg/mL,纯度为96.71%;WB实验表明目的蛋白能与Mtb阳性血清相应抗体发生反应。对60份Mtb阳性血清及60份Mtb阴性血清进行检测得出其灵敏度为90.00%,特异性为93.33%,阳性预测值为93.10%,阴性预测值为90.32%,符合率为91.67%,McNemer检验的结果提示与"金标准"诊断结果无差异,Kappa=0.833,提示两种方法诊断结果一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性优异的Mtb多表位诊断抗原,作为诊断抗原可以应用于Mtb的血清学检测中。     

人二氢乳清酸脱氢酶蛋白的表达、纯化及其与新型抑制剂的晶体结构

人二氢乳清酸脱氢酶（human dihydroorotate dehydrogenase, hDHODH）是催化嘧啶从头合成途径的一个关键酶。近年来,多种研究表明,抑制该酶可缓解类风湿性关节炎的症状。但该酶的抑制剂甚少,寻找该酶的高效抑制剂具有重要意义。本研究利用PCR技术扩增hDHODH基因,构建重组质粒pET-19b-hDHODH,并在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli ) BL21(DE3)中表达,获得可溶性蛋白质。用Ni2+-NTA亲和层析柱对蛋白质进行纯化,获得较高（90%）纯度的hDHODH蛋白,将蛋白质与抑制剂3-(5-乙硫基)-1H-1, 2, 4-三氮唑-3-)苯甲酸和底物DHO混合孵育。用Hampton试剂盒初筛晶体并用棋盘法进行优化,获得晶形完美、衍射能力很强的hDHODH蛋白复合物单晶。用X射线衍射晶体,用CCP4、Coot软件解析结构,获得hDHODH蛋白复合物晶体结构。从解析的结构中可以看出,抑制剂与蛋白质的吻合度非常高,且抑制剂通过亲水的羧基端与蛋白质356位和147位的酪氨酸形成氢键网络。抑制剂的5元环与蛋白质359位的亮氨酸和360位的苏氨酸相互作用,使抑制剂与蛋白质牢固结合。该复合物晶体结构的顺利解析,将为开发新型特异性抗类风湿性关节炎药物提供重要基础。     

Purification and characterization of cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from the dromedary camel

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (EC 1.2.1.12),a key enzyme ofcarbon metabolism,was purified and characterized to homogeneity from skeletal muscle of Camelusdromedarius.The protein was purified approximately 26.8 folds by conventional ammonium sulphatefractionation followed by Blue Sepharose CL-6B chromatography,and its physical and kinetic propertieswere investigated.The native protein is a homotetramer with an apparent molecular weight of approximately146 kDa.Isoelectric focusing analysis showed the presence of only one GAPDH isoform with an isoelectricpoint of 7.2.The optimum pH of the purified enzyme was 7.8.Studies on the effect of temperature onenzyme activity revealed an optimal value of approximately 28-32 ℃ with activation energy of 4.9 kcal/mol.The apparent K_m values for NAD~ and DL-glyceraldehyde-3-phophate were estimated to be 0.025±0.040mM and 0.21±0.08 mM, respectively. The V_(max) of the purified protein was estimated to be 52.7±5.9 U/mg.These kinetic parameter values were different from those described previously, reflecting protein differencesbetween species.     

融和蛋白GST-SUMO-MT在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性研究

将编码融合蛋白GST-SUMO-MT的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-GS-MT并转化到大肠杆菌Origami（DE3）中。20℃,1mM的IPTG诱导20h后,获得分子量约为43Kd的融合蛋白,表达量占菌体上清总蛋白的38.4％。利用谷胱甘肽交联琼脂糖（Glutathione Sepharose 4B）凝胶柱和Sephardex G-25分子筛联用可以得到纯度为95%以上的融合蛋白,得率约为70mg/L。该融合蛋白可与GST抗体产生阳性反应。融合蛋白GST-SUMO-MT可以显著提高宿主对Cd2+、Zn2+和Cu2+离子聚积的能力,其耐受能力比对照组分别提高4.2倍、4倍及1.6倍。此外,原子吸收光谱法测定,每分子GST-SUMO-MT可以结合2-3个Cd2+离子。     

大肠杆菌表达的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的分离纯化及其二聚体分析

采用阴离子交换和凝胶过滤色谱法纯化大肠杆菌高密度培养所表达的重组葡激酶－水蛭素融合蛋白（rSFH）,经SDS-PAGE和RP-HPLC分析纯度达到98％以上,每升发酵液得率约0.7g。同时利用疏水色谱、MALDI-TOF对纯化过程中出现的rSFH同源二聚体的分析和表面疏水面积的计算及利用高效排阻色谱（HPSEC）分析NaCl、温度对rSFH的可逆二聚化行为的影响,认为疏水作用在rSFH的可逆二聚化行为中发挥着重要作用。