β-TCP三维支架用于骨髓间充质干细胞原位冻存研究

目的:探索骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)三维扩增原位冻存策略实践性及其对传代迁徙和成骨分化能力的影响.方法:制备β-TCP三维支架,相对2D平板考察三维扩增细胞数,冻存后以CCK-8染色计数考察收获冻存效率,迁徙率,并以ALP染色考察总体成骨分化水平和比分化活力.结果:与2D平板相比,3D培养速率提升7倍,原位冻存细胞收获存活效率由传统消化吹打方式的55.9%提升为81.3%;冻存处理后其迁徙率传代效率下降无统计学意义(P>0.05),比ALP活性经冻存处理非但未下降,反而在迁徙传代支架上显著性提升.结论:利用β-TCP三维支架扩增、传代MSC并进行原位冻存不影响传代迁徙能力,对成骨分化水平反而有贡献作用,具有较好的科研及工业生产应用前景.     

原位PCR技术及其应用

本文介绍了原位ＰＣＲ的主要进展、基本步骤,并对其在外源基因检测,基因变异,基因表达汲定位等方面的应用作一综述。     

肝肾移植术后患者隐球菌感染的临床特征分析

目的研究肝、肾移植术后患者隐球菌感染的临床特征。方法选取2010年1月到2015年7月来浙江大学医学院附属第一医院就诊的肝、肾移植术后并确诊为隐球菌感染的患者,对其临床特征进行回顾性分析。结果研究周期内有23例患者符合入组要求,其中肾移植术后21例、肝移植术后2例。对23例患者进行分析,发现单纯隐球菌肺炎6例(占26.0%)、单纯隐球菌性脑膜炎6例(占26.0%)、隐球菌性脑膜炎合并隐球菌肺炎8例(占34.7%)、隐球菌败血症2例(占8.6%),皮肤隐球菌感染1例(占4.3%)。所有隐球菌肺炎均经肺穿刺病理确诊,临床表现以发热,咳嗽咳痰,气急症状居多。胸部CT表现为结节、空洞、肿块、渗出等。所有隐球菌脑膜炎患者中9例经脑脊液培养出新生隐球菌、7例脑脊液墨汁染色见隐球菌,其中3例培养及涂片均为阳性。临床表现以头痛、发热、呕吐症状居多,1例并发癫痫,1例并发意识障碍。所有患者分别给予氟康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶针、伏立康唑等抗真菌治疗,其中3例隐球菌脑膜炎患者予两性霉素B鞘内注射。经1~6个月治疗后,总体预后情况良好(好转22例,死亡1例)。结论肝、肾移植术后患者因免疫抑制剂的长期使用,隐球菌感染值得重视,其临床症状不典型,易误诊及漏诊,通过对其主要症状及影像学特点判断,结合肺穿刺活检、脑脊液检查、血培养等检查手段,可明显提高隐球菌感染的检出率,从而做到早诊断,早治疗,降低病死率。     

原位分子杂交法检测恙螨体内肾综合征出血热病毒核酸的研究

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）在恙螨体内的分布和定位,采用原位分子杂交技术检测恙螨体内ＨＦＲＳＶＲＮＡ。结果发现：原位分子杂交技术的检出阳性率较ＩＦＡＴ高;ＨＦＲＳＶ阳性信号颗粒呈弥散分布,多见于恙螨幼虫和若虫的腹部组织细胞内,该部位是恙螨的卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞。前体组织细胞内少见;个别幼虫和若虫的前足和中足细胞内亦可见到ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号。在原位分子杂交中,若虫组织细胞内的ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号较幼虫密集而且量多,表明ＨＦＲＳＶ在恙螨体内可传递并有增殖现象     

人单拷贝及重复DNAF序列的原位PCR

在培养的人小肠癌转移腹水细胞系细胞中进行了Ｙ染色体特异的重复序主单 拷贝序列的原位扩增与检测,结果显示原位ＰＣＲ法的灵敏度比直拉的原位杂交法明显提高。     

镜湖沉积物中轮虫休眠卵的原位萌发

将2004年春季采于芜湖市镜湖的沉积物样品在不同季节进行原位萌发发现,除冬季未见有轮虫孵出外,其余3个季节共孵出轮虫39种,隶属于7科19属;大湖区每200ml沉积物中休眠卵萌发出的轮虫数量平均为212.2个±48.9个,显著高于小湖区的39.1个±10.3个。大湖区沉积物在夏季萌发出的小巨头轮虫(Cephalodella exigua)、大肚须足轮虫(Euchlanis dilatata)和壶状臂尾轮虫(Brachionus urceolaris)、秋季萌发出的裂足臂尾轮虫(B.diversicornis)和角突臂尾轮虫(B.angularis)以及春季萌发出的暗小异尾轮虫(Trichocerca pusilla)和等刺异尾轮虫(T.similis)分别占各季节总萌发数的51.1%、19.7%、15.7%、14.7%、11.1%、38.4%和23.7%,小湖区沉积物在夏季萌发出的多须伪前翼轮虫(Proalides tentaculates)和暗小异尾轮虫、秋季萌发出的裂痕龟纹轮虫(Anuraeopsis fissa)、尖趾单趾轮虫(Monostyla closterocerca)和大肚须足轮虫以及春季萌发出的尖趾单趾轮虫、盘状鞍甲轮虫(Lepadella patella)和暗小异尾轮虫分别占各季节总萌发数的53.9%、31.6%、18%、17%、13%、31%、24.1%和17.2%。各季节萌发出的轮虫与同季节水体中存在的轮虫种类及数量间存在的较大差异表明,那些常年存在于水体中的轮虫所产的休眠卵的萌发对其种群增长的直接贡献可能不大;而那些每年都要从水体中消失一段时间的轮虫所产的休眠卵的萌发在其种群重建中的作用可能因种类的不同而异。     

人单拷贝及重复DNA序列的原位PCR

在培养的人小肠癌转移腹水细胞系细胞中进行了Y染色体特异的重复序列及单拷贝序列的原位扩增与检测.结果显示原位PCR法的灵敏度比直接的原位杂交法明显提高.     

玉米两个RFLP标记的原位单杂交与共杂交定位的比较

ＲＦＬＰ标记ｂｎ１８．２３和 ｕｍｃ１１１位于玉米遗传日第 ４连锁群近端,彼此密切连锁但次序尚未确定。用生物素标记对它们进行了原位单杂交和共杂交的比较定位。在植物中,这类原位共杂交的研究为首次报道。在单一探针的原位杂交中 ｕｍｃ１１１被定位在第 １、 ４和９染色体长上,与着丝粒的百分距离分别是７．３６±２．６５、６３．６７±１．０７、４７．８７±２．９０。ｂｎ１８．２３被定位在第４和８染色体长臂上,与着丝粒的百分距离分别是８７．４２±２．４５和２７．６０±１．７５,清楚地表明了这两个标记在第４染色体上的次序。ｂｎ１８．２３和ｕｍｃ１１１分别与编码过氧化氢酶的ｃａｔ３基因和编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的ｃｄｅ２Ａ基因紧密连锁。根据供试ＲＦＬＰ标记检出位点推断了基因ｃｄｃ２Ａ和ｃａｔ３的物理位置。原位共杂交在第 ４染色体长臂上同时显示出了ｕｍｃ１１１和ｂｎ１８．２３两个标记的杂交信号,它们的位置分别与单一探针原位杂交的位置基本吻合。这为低拷贝或单一拷贝等小片段ＤＮＡ物理定位的可靠性以及它们共杂交的可行性提供了令人信服的证据。     

塑料孔板原位免疫细胞化学、免疫荧光、特染方法的建立

细胞免疫化学、细胞各种特殊染色是我们常用的科研实验方法。常用的是盖玻片爬片染色法[1,2,3],此方法在研究工作中,操作繁琐、片薄易碎、去污不彻底、背景时常不洁净、细胞分布不均易脱落,影响了照片的清晰度。因此,我们一直摸索用塑料孔板原位染色代替盖玻片爬片染色,经过反复实验研究,解决了塑料孔板染色中的固定剂和封片剂两大难题,大大简化了操作过程,提高了染色的质量和实验结果的准确性。现将此方法介绍如下:材料和方法1.材料24孔培养板或6孔培养板4%多聚甲醛配制:4g多聚甲醛溶于PBS中,定容到100ml,存放在密闭容器中,65℃水浴中溶解,溶液4℃保存,两周内使用。封片剂配制:明胶7g溶于蒸馏水25ml温箱溶解,甘油35ml加蒸馏水40ml再加石碳酸0.25mg,二者混匀后温箱加热过滤。2.方法铺板:取对数生长期的细胞,经0.25%胰酶消化制成细胞悬液,计数24孔板铺2×104/ml细胞,6孔培养板2×105/ml细胞。根据孔底面积大小的不同,铺的细胞数也不同,一般以生长2-3d,空白比为50%为好,太稀、太密细胞形态不能充分展现。固定:加培养液2-3d,吸出培养液,用PBS洗一遍,加入4%多聚甲醛1-2ml,固定...     

综述: 冷冻超分辨光电融合成像技术 ——新挑战，新机遇

冷冻超分辨光电融合成像技术近年来发展迅速,该技术结合了荧光显微镜特异性标记与冷冻电镜超高分辨率的优势,成为细胞原位结构研究的新手段,有望发展成为下一代成像技术.本文从发展背景、应用领域等几个方面,介绍了冷冻超分辨光电融合成像技术的概况及未来发展前景.