多靶向RNA干扰技术在基因治疗中的应用与前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)通过转录后基因沉默效应特异性抑制靶基因的表达,其沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这项技术成为生物医学领域研究基因治疗的重要工具。阐述RNAi技术的特点和RNAi疗法的现状,特别是多靶小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)目前的发展态势及其各种结构性修饰,通过使用这些结构修饰的siRNA提高基因沉默的效率,将有助于提高疗效。但该技术在广泛应用于临床之前,仍存在一些亟待解决的问题与面临的挑战,需进一步研究。     

Exosome and Exosomal MicroRNA:Trafficking,Sorting, and Function

Exosomes are 40–100 nm nano-sized vesicles that are released from many cell types into the extracellular space. Such vesicles are widely distributed in various body fluids. Recently,m RNAs and micro RNAs(mi RNAs) have been identified in exosomes, which can be taken up by neighboring or distant cells and subsequently modulate recipient cells. This suggests an active sorting mechanism of exosomal mi RNAs, since the mi RNA profiles of exosomes may differ from those of the parent cells. Exosomal mi RNAs play an important role in disease progression, and can stimulate angiogenesis and facilitate metastasis in cancers. In this review, we will introduce the origin and the trafficking of exosomes between cells, display current research on the sorting mechanism of exosomal mi RNAs, and briefly describe how exosomes and their mi RNAs function in recipient cells.Finally, we will discuss the potential applications of these mi RNA-containing vesicles in clinical settings.     

东亚三角涡虫Djtraf3基因的时空表达模式

肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)作为TRAF家族的成员之一,通过介导TLRs信号通路,参与动物的免疫反应。通过构建东亚三角涡虫Djtraf3的cDNA文库获得Djtraf3基因并分析基因结构。结果发现,该最大开放阅读框为564bp,编码的蛋白质含187个氨基酸,含有1个TRAF结构域。进化分析表明,DjTRAF3和果蝇的TRAF3聚群,位于进化树的基部;整体原位杂交结果显示,在涡虫成体及不同再生阶段,Djtraf3在整个肠部表达。这些结果为进一步探究其功能提供了依据和方向。     

长链非编码RNA(lncRNA)在氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞损伤中表达谱的变化

目的:探讨长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的损伤人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)与正常HUVEC中表达谱的差异。方法:采用lnc RNA芯片检测ox-LDL诱导的损伤HUVEC与正常HUVEC中lncRNA及mRNA的表达差异,筛选出HUVEC损伤相关的lncRNA。结果:相对于正常HUVEC,在ox-LDL诱导的损伤HUVEC中表达上调和下调超过2倍的lncRNAs和m RNAs分别有139种和113种,上调和下调超过4倍的lncRNAs和mRNAs分别有35种和28种。结论:与正常HUVEC比较,ox-LDL诱导的损伤HUVEC中lncRNA的表达谱显著变化,lncRNA可能在血管内皮细胞损伤过程中发挥一定作用。     

PEI-CS/siRNA复合颗粒对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU中MRE11表达的影响

目的:探讨聚乙烯亚胺-壳聚糖(PEI-CS)/si RNA复合颗粒对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU中MRE11表达的影响。方法:采用复凝聚法将PEI-CS(100μg/m L)与不同浓度的MRE11 si RNA-FAM形成PEI-CS/si RNA复合颗粒,并转染BEL7402/5-FU细胞,用荧光显微镜和Real-time PCR检测转染效率和沉默效率。结果:荧光显微镜观察结果显示:转染细胞48 h后,3.125、6.25、12.5、25、50μg/m L的si RNA与PEI-CS形成的复合颗粒的转染率分别为62.31%、76.09%、79.99%、86.49%、96.59%。转染细胞48、72、96 h后,12.5μg/m L的si RNA与PEI-CS形成的复合颗粒的转染率分别为78.22%、55.76%、42.85%,25μg/m L的si RNA与PEI-CS形成的复合颗粒的转染率分别为83.67%、74.23%、67.45%。Real-time PCR检测结果显示:25μg/m L的si RNA与PEI-CS形成的复合颗粒转染48小时后,对BEL7402/5-FU细胞中MRE11基因的沉默效率为35.4%。结论:聚乙烯亚胺-壳聚糖/si RAN复合颗粒能有效转染肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU,并对BEL7402/5-FU细胞中MRE11基因表达有一定抑制作用。     

Recent advances in the study of HPV-associated carcinogenesis

Human papillomaviruses(HPVs) cause virtually all cervical cancers, the second leading cause of death by cancer among women, as well as other anogenital cancers and a subset of head and neck cancers. Approximately half of women, who develop cervical cancer die from it. Despite the optimism that has accompanied the introduction of prophylactic vaccines to prevent some HPV infections, the relatively modest uptake of the vaccine, especially in the developing world, and the very high fraction of men and women who are already infected, means that HPV-associated disease will remain as a significant public health problem for decades. In this review, we summarize some recent findings on HPV-associated carcinogenesis, such as mi RNAs in HPV-associated cancers, implication of stem cells in the biology and therapy of HPV-positive cancers, HPV vaccines, targeted therapy of cervical cancer, and drug treatment for HPV-induced intraepithelial neoplasias.     

油茶CoSAD基因载体的构建、鉴定及功能分析

为揭示油茶( Camellia oleifera Abel)硬脂酰-ACP脱饱和酶( SAD)基因(即CoSAD基因)的功能,构建了该基因的原核表达载体pET28b-CoSAD、植物表达载体pBI121-CoSAD和RNA干扰载体pBI121-CoSAD RNAi,并采用PCR扩增及双酶切方法对3类载体进行鉴定;在此基础上,对原核表达载体中的CoSAD基因进行诱导表达分析,并对pBI121-CoSAD转化的拟南芥〔Arabidopsis thaliana ( Linn.) Heynh.〕sad突变体植株和pBI121-CoSAD RNAi转化的拟南芥野生型植株进行转基因鉴定和主要脂肪酸成分含量分析。 PCR扩增和双酶切结果显示：从 pET28b-CoSAD、pBI121-CoSAD和pBI121-CoSAD RNAi 载体的阳性克隆中均可获得目的条带,表明这3类载体均构建成功;用1 mmol·L-1 IPTG分别诱导0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 h,CoSAD基因均能够在pET28b-CoSAD转化的大肠杆菌BL21感受态细胞中正常表达,能够获得与预测结果相符的相对分子质量约47000的特异目的蛋白条带,且蛋白活性随诱导时间的延长而升高。从pBI121-CoSAD转化的拟南芥突变体植株和pBI121-CoSAD RNAi转化的拟南芥野生型植株中也均可扩增出目的条带。 GC-MS分析结果显示：与拟南芥野生型植株相比,其突变体植株的硬脂酸和棕榈酸含量较高、油酸和棕榈油酸含量较低;但突变体植株经pBI121-CoSAD转化后,硬脂酸和棕榈酸含量降低而油酸和棕榈油酸含量提高;野生型植株经过pBI121-CoSAD RNAi转化后,硬脂酸和棕榈酸含量提高、油酸和棕榈油酸含量降低,表明pBI121-CoSAD转化能够促进拟南芥sad突变体植株体内饱和脂肪酸向不饱和脂肪酸转化,而pBI121-CoSAD RNAi转化对拟南芥SAD基因的表达有明显的抑制作用,这2种重组质粒均可影响拟南芥植株的脂肪酸含量。研究结果表明：油茶CoSAD基因具有调控饱和脂肪酸(硬脂酸和棕榈酸)向不饱和脂肪酸(油酸和棕榈油酸)转化的功能,对茶油的脂肪酸组成具有关键的调控作用。     

《细胞》：无包膜dsRNA病毒入侵机制研究

国际著名学术期刊《细胞》（Cell）近日以封面文章发表了无包膜dsRNA病毒入侵机制方面的研究新进展。该研究成果由中科院武汉病毒所水生病毒及结构与功能研究学科组与美国加州大学洛杉矶分校的科研人员共同完成。     

HRB2基因对细胞增值影响的研究

目的:研究HRB2基因对细胞增值的影响.方法:设计4对HRB2 RNA寡核苷酸片段,经退火制备的双链DNA oligo,连接经双酶切的线性化PLKO.1-TRC-SP6载体上,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序,质粒抽提,应用Lipofectamine2000将质粒导入293T细胞,包装成慢病毒,再感染靶细胞293T,用嘌呤霉素筛选15天后,收集细胞抽提RNA,实时定量RT-PCR检测HRB2mRNA水平,评价干扰效果.Western免疫印迹进一步确认有效作用靶点.通过划痕愈合实验和绘制生长曲线研究HRB2基因对细胞增值的影响.结果:载体构建成功.包装成慢病毒感染293T细胞系,发现:2号和4号靶点敲减HRB2基因效率达84%和88%.差别有统计学意义.通过western进一步证实了2号和4号是抑制HRB2的有效作用靶点.划痕愈合实验和绘制生长曲线的结果显示2号和4号靶点细胞株细胞生长受到抑制,并且4号较2号稍明显.结论:成功构建并筛选了携带有人HRB2基因的shRNA慢病毒载体及有效靶点,研究发现HRB2基因对细胞增值产生了影响,这为进一步研究HRB2的生物学功能提供了实验平台.